卵形鯧鲹分子標(biāo)記的篩選與應(yīng)用.pdf

1、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）具有生長速度快，食性簡單，肉質(zhì)鮮美，容易飼養(yǎng)等一系列優(yōu)點，已經(jīng)成為我國華南沿海地區(qū)一種重要的海水養(yǎng)殖品種。由于目前卵形鯧鲹未經(jīng)過人工選育，在繁、育過程中隨機(jī)挑取親本可能導(dǎo)致近交衰退，因此急需評價卵形鯧鲹育種群體的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，為在遺傳選育中親本選擇和配對策略的制定提供參考依據(jù)。本研究采用FIASCO法構(gòu)建了卵形鯧鲹微衛(wèi)星（Microsatellite, SSR）富集文庫，測序篩

2、選到21個多態(tài)性微衛(wèi)星位點，利用篩選的多態(tài)性微衛(wèi)星位點評價了廣東大亞灣和海南三亞兩個育種群體遺傳多樣性水平和種群遺傳結(jié)構(gòu)，為育種群體親本配對策略的制定提供了依據(jù)；測序獲得了卵形鯧鲹線粒體基因組DNA，利用卵形鯧鲹線粒體基因組DNA序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的6種鲹科魚類線粒體基因組DNA序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究；由于從形態(tài)上很難區(qū)分卵形鯧鲹雌雄個體，給遺傳育種過程中雌雄親本的配對帶來了很大的困難，為了建立雌雄個體的分子識別技

3、術(shù)，本研究嘗試?yán)肁FLP和RAPD技術(shù)對卵形鯧鲹雌雄個體進(jìn)行了全基因組掃描，以期篩選雌雄個體特異的分子標(biāo)記。本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　(1)卵形鯧鲹微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選
　　使用“磁珠富集法”建立了卵形鯧鲹微衛(wèi)星序列富集文庫，篩選文庫中的陽性克隆進(jìn)行測序分析，共獲得了約450個菌落的微衛(wèi)星富集文庫，得到320個陽性克隆，測序其中的219個克隆，有150個克?。?8.5﹪）含有重復(fù)次數(shù)≧5微衛(wèi)星序列；利用這些序列共設(shè)計了1

4、37對微衛(wèi)星引物，其中108對引物成功擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，利用48個卵形鯧鲹個體評價這些微衛(wèi)星位點的多態(tài)性，結(jié)果表明其中21個微衛(wèi)星位點具有多態(tài)性，該群體的等位基因數(shù)Na為2-10，觀測雜合度HO為0.083-0.792，平均為0.585，期望雜合度He為0.081-0.886，平均為0.589，多態(tài)性信息含量PIC為0.0767-0.8623；6個位點(TO33，TO47，TO67，TO80，TO132-1，TO145)明顯偏離HE

5、W（P<0.01）。
　　(2)2個卵形鯧鲹育種群體遺傳多樣性比較分析
　　利用篩選的21個微衛(wèi)星位點中的11個多態(tài)性微衛(wèi)星位點，對海南三亞和廣東大亞灣2個育種群體進(jìn)行了遺傳多樣性比較分析，研究結(jié)果表明廣東大亞灣和海南三亞2個卵形鯧鲹育種群體的平均等位基因Na分別為5.0和3.6，平均有效等位基因Ne為2.965和2.244，觀測雜合度Ho分別為0.292-0.814和0.207-0.840，期望雜合度He分別為0.307-

6、0.813和0.189-0.761，海南三亞群體中多態(tài)信息含量PIC為0.014-0.719，平均為0.509，廣東大亞灣群體的PIC為0.168-0.711，平均為0.436。海南三亞群體有5個位點偏離哈迪-溫伯格平衡（P<0.05），廣東大亞灣群體有2個位點偏離哈迪-溫伯格平衡；2個群體間的遺傳相似系數(shù)為0.561，遺傳距離為0.578，遺傳分化指數(shù)（Fst）為0.152。聚類分析和Structure軟件分析顯示海南三亞和廣東大亞灣

7、2個卵形鯧鲹群體各為一支，2個群體間具有較大的遺傳分化，可作為2個育種群體管理，2個群體間進(jìn)行雜交選育預(yù)期可獲得較好的遺傳進(jìn)展。
　　(3)卵形鯧鲹性別特異性分子標(biāo)記的篩選
　　利用AFLP和RAPD技術(shù)進(jìn)行卵形鯧鲹雌雄個體的全基因組掃描，以期獲得雌雄個體特異分子標(biāo)記。利用64對AFLP引物組合，共擴(kuò)增出2322個位點，其中18個引物組合（26.6％）產(chǎn)生可能與性別相關(guān)聯(lián)的擴(kuò)增，未篩選到雌雄個體特異的分子標(biāo)記；利用238條R

8、APD引物篩選雌雄特異的分子標(biāo)記，共有26個隨機(jī)引物產(chǎn)生可能與性別相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，也未篩選到卵形鯧鲹雌雄個體特異性的DNA標(biāo)記。
　　(4)卵形鯧鲹線粒體全基因組克隆及鲹科魚類發(fā)育關(guān)系分析
　　根據(jù)鲹科魚類線粒體序列同源性設(shè)計10組引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序分析，獲得了卵形鯧鲹線粒體基因組DNA序列，線粒體基因組的大小為16564bp，其中包含13個蛋白編碼基因，2個核糖體RNA基因（12SrRNA和16SrRNA），22個轉(zhuǎn)運(yùn)

9、RNA基因以及一個D-loop區(qū)域，絕大部分基因為重鏈，只有NADH脫氫酶亞基6（ND6）和8種tRNA（Gln，Ala，Asn，Cys，Try，Glu，Pro，Ser）以輕鏈形式編碼蛋白，與另外一個發(fā)表于NCBI的序列（KF356397）相比，兩個序列的同源性為99﹪，只有在16SrRNA和Control region區(qū)域有較大的差異，分別占0.17％和1.7％，由于具有較大的序列差異，這2個基因能夠為后期卵形鯧鲹種群結(jié)構(gòu)的研究提供理