卵形鯧鲹MHCⅡβ和GILT基因的表達(dá)調(diào)控及其多態(tài)性與抗菌性狀的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)肉質(zhì)鮮美，生長(zhǎng)速度快，可攝食人工配合飼料，是我國(guó)熱帶、亞熱帶海域重要的網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一。然而近年來(lái)由于病害頻發(fā)，給卵形鯧鲹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究卵形鯧鲹免疫基因與抗病性狀關(guān)聯(lián)性，確定免疫分子標(biāo)記，建立免疫防控技術(shù)，對(duì)支撐卵形鯧鲹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究從實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)序獲得的卵形鯧鲹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了主要組織相容性復(fù)合體Ⅱβ(majorhistoco

2、mpatibility complexⅡβ，MHCⅡβ)和γ-干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(interferon-γ-inducible lysosomal thiol reductase，GILT)的部分序列，利用RACE技術(shù)克隆獲得MHCⅡβ和GILT基因cDNA全序列，以此為基礎(chǔ)比對(duì)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了MHCⅡβ和GILT基因組全序列，分析了其組織表達(dá)和細(xì)菌感染前后表達(dá)譜特征，篩選了基因多態(tài)性位點(diǎn)，分析了基因多態(tài)性與抗菌性狀的相關(guān)

3、性，取得的主要結(jié)果如下：
　　一、卵形鯧鲹MHCⅡβ表達(dá)調(diào)控及其基因多態(tài)性與抗菌性狀的關(guān)聯(lián)分析
　　結(jié)論：ToMHCⅡβcDNA全長(zhǎng)為1472 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)747 bp，編碼248個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示卵形鯧鲹與其他魚(yú)類(lèi)親緣關(guān)系較近，與兩棲類(lèi)和哺乳類(lèi)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　組織表達(dá)分析表明MHCⅡβmRNA在卵形鯧鲹13個(gè)組織中均有表達(dá)，在脾和頭腎中表達(dá)量較高，在鰭中表達(dá)量最低。感染美人魚(yú)發(fā)光桿菌(P

4、hotobacterium damselae)后，卵形鯧鯵 MHCⅡβmRNA在在肝、脾、頭腎、腸四個(gè)組織中總體均有上調(diào)表達(dá)。
　　本研究對(duì)核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，在278 bp的序列中并未發(fā)現(xiàn)缺失、移碼和插入突變，序列中共發(fā)現(xiàn)了69個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，變異率為24.8％，其中存在6個(gè)雙核苷酸突變區(qū)，7個(gè)三核苷酸突變區(qū)，2個(gè)四核苷酸突變區(qū)。整個(gè)核苷酸突變的熱點(diǎn)區(qū)域分布于18-50bp之間。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)278 bp的核苷酸序列翻譯為由72個(gè)

5、氨基酸組成的多肽序列，有28個(gè)位點(diǎn)是多態(tài)的，變異率為38.29%。通過(guò)比對(duì)將下列5個(gè)氨基酸位點(diǎn)作為PBR位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析，統(tǒng)計(jì)分析表明，所有序列在PBRs區(qū)的平均w值為6.60(>1)，證明該區(qū)域的核苷酸多樣性受正向選擇的影響。對(duì)獲得的基因在抗感組和易感組中進(jìn)行頻率分布的統(tǒng)計(jì)分析，其中有6個(gè)只出現(xiàn)在抗感群體中，有13個(gè)只出現(xiàn)在易感群體中，最終，有6個(gè)被選做下一步的統(tǒng)計(jì)分析中，并對(duì)其在兩組中的分布頻率進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果顯示，TO-DA

6、B-01在抗感群體中的分布頻率(0.223)要顯著地高于在易感群體中的分布頻率(0.058)(P＜0.01)，而TO-DAB-04，TO-DAB-05，和TO-DAB-10在易感群體中的分布頻率(0.045，0.120，0.063)要顯著地高于在抗病群體中的分布頻率(0.008，0.050，0.020)(P＜0.01)。因此可以初步推斷，TO-DAB-01與卵形鯧鲹對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌的抗感性顯著相關(guān)，而TO-DAB-04, TO-DAB-

7、05，和TO-DAB-10與卵形鯧鲹對(duì)美人魚(yú)發(fā)光桿菌的易感染性具有顯著關(guān)聯(lián)性。為探討卵形鯧鲹基因組中存在的MHCⅡβ基因位點(diǎn)數(shù)目，對(duì)每個(gè)個(gè)體的5個(gè)陽(yáng)性克隆序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果表明，單個(gè)個(gè)體所檢測(cè)的單倍型數(shù)目介于2-3之間，暗示在卵形鯧鲹基因組中至少存在2個(gè)MHCⅡβ基因位點(diǎn)。
　　二、卵形鯧鲹GILT表達(dá)調(diào)控及其基因多態(tài)性與抗菌性狀的關(guān)聯(lián)分析
　　結(jié)論：ToGILT基因全長(zhǎng)6837bp,包括7個(gè)外顯子，6個(gè)內(nèi)含子，符合G

8、T-AG規(guī)則。包括232 bp的5′UTR，771 bp的ORF和1746 bp的3′UTR。在起始點(diǎn)上游以及906bp存在啟動(dòng)元件CAAT盒，微衛(wèi)星片段用方框表示。ToGILT基因共編碼256個(gè)氨基酸，其理論相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)約為28.6kD和5.97。GILT基因cDNA全長(zhǎng)2749 bp，功能基序位點(diǎn)有蛋白激酶A(PKA)(77NSG79)、蛋白激酶G(PKG)(77NSG79)，5個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-豆蔻酰基化

9、位點(diǎn)，胰島素受體 C(INSR)(51EYI53、176EYT178)和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子(CKI)(153TSD155、157TST159)，未發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)，但有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基。
　　通過(guò)檢測(cè)ToGILT mRNA在卵形鯧鲹各組織中相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示ToGILT mRNA在13個(gè)組織中均有表達(dá)。其中在肌肉的表達(dá)量最低，脾中的表達(dá)量最高肝臟和頭腎中的表達(dá)量與其他組織的表達(dá)量存在顯著差異(P＜0.05)。同樣

10、感染美人魚(yú)發(fā)光桿菌后，ToGILT mRNA在肝、脾、頭腎、腸四個(gè)組織中總體均有上調(diào)表達(dá)。肝和腸組織在感染細(xì)菌后，表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，在24 h的表達(dá)量達(dá)到最高，然后開(kāi)始有下降的趨勢(shì)；脾和頭腎組織的表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，在12h表達(dá)量最高，然后開(kāi)始有下調(diào)趨勢(shì)，在72 h時(shí)基本回復(fù)初始表達(dá)量。
　　ToGILT基因存在一個(gè)SNP位點(diǎn)，其中基因型CG在易感群體中的分布頻率(0.852)分別要顯著地高于在抗感群體中的分布頻率(0.148)(P＜0