IL-17通過抑制MDSCs凋亡影響小鼠抗瘤免疫應答的實驗研究.pdf

1、目的：體外觀察白細胞介素17（interleukin17，IL-17）對小鼠髓源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells）凋亡的影響，并探討ERK1/2分子在其中的作用；于Lewis荷瘤小鼠體內研究IL-17是否通過調控MDSCs凋亡而影響腫瘤的生長。
　　方法：
　?。?）通過皮下注射Lewis細胞構建荷瘤小鼠模型，采用免疫磁珠分選技術（MACS）分離脾臟MDSCs細胞，常規(guī)培養(yǎng)。經IL

2、-17處理后，使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs凋亡情況，通過Western-blot技術檢測BCL-2的表達以及ERK1/2的磷酸化水平。
　?。?）在MDSCs培養(yǎng)體系中加入不同濃度ERK1/2分子磷酸化抑制劑（U0126）預處理，再經IL-17作用，運用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs的凋亡情況并通過Western-blot技術檢測BCL-2的表達水平。
　?。?）在荷瘤小鼠體內腹腔注射I

3、L-17，2.5μg/只/次，共三次。觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤重量和大??；通過實時定量PCR（qRT-PCR）技術檢測核蛋白（Ki67）mRNA、誘導性一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表達情況。采用流式細胞術（FCM）檢測樹突狀細胞、巨噬細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞的比例，免疫熒光技術（IF）檢測腫瘤組織中MDSCs的浸潤情況。
　?。?）IL-17處理荷瘤小鼠后，通過MACS分選出MDSCs細胞。運用Western-

4、blot技術檢測細胞中ERK1/2磷酸化水平。常規(guī)培養(yǎng)后，使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs的凋亡情況，采用精氨酸酶（ARG-1）試劑盒檢測ARG-1活性，運用Western-blot技術檢測BCL-2表達水平。
　　(5) IL-17處理荷瘤小鼠后，使用吉西他濱清除荷瘤小鼠體內MDSCs，過繼轉移經U0126處理后的MDSCs（簡稱過繼轉移模型）。測量腫瘤體積、重量，采用qRT-PCR檢測腫瘤組織中iNOS mR

5、NA表達水平，通過MACS分選MDSCs，常規(guī)培養(yǎng)，使用AnnexinV/PI凋亡試劑盒檢測MDSCs凋亡情況，使用ARG-1試劑盒檢測ARG-1活性，運用Western-blot技術檢測BCL-2表達水平。
　　結果：
　　(1) IL-17處理MDSCs細胞24h，對照組活細胞比例為（45.33±1.556）％，IL-17處理組為（59.55±2.831）%（ P<0.001），晚期凋亡細胞比例對照組為（22.87±1.

6、349）%，IL-17處理組為（13.70±1.003）%（P<0.01）。Western-blot結果顯示：IL-17處理組ERK1/2分子磷酸化水平（P<0.001）、BCL-2表達水平都明顯上調（P<0.01）。
　　(2)在MDSCs培養(yǎng)體系中加入ERK1/2分子磷酸化抑制劑（U0126）預處
　　理，再加入IL-17處理。24h后，當U0126濃度為7.5μM時，空白對照組活細胞比例為（39.08±2.718）%，

7、U0126處理組為（15.57±1.009）%（P<0.001），空白對照組晚期凋亡細胞比例為（8.007±1.777）%，U0126處理組為（26.95±1.179）%（P<0.01）。Western-blot檢測發(fā)現，U0126處理組抗凋亡蛋白BCL-2表達明顯減少。
　　(3)與PBS對照組相比， IL-17處理荷瘤小鼠后，腫瘤生長速度加快（ P<0.01），腫瘤體積增加[PBS組為2.753±0.7803cm3， IL-1

8、7處理組為6.000±0.8653cm3）（P<0.05）]，腫瘤重量增加[PBS組為1.886±0.2020g，IL-17處理組為3.480±0.4586g（P<0.05）]，核蛋白Ki67mRNA表達增加（P<0.05）。FCM結果顯示：對照組脾臟中MDSCs數量為（2.187±0.2541）×107、比例為（13.40±0.3606）%， IL-17處理組數量為（3.967±0.1133）×107，比例為（24.43±1.1240

9、）%（P<0.001）。IF結果顯示腫瘤組織中MDSCs浸潤數目增加， qRT-PCR檢測發(fā)現腫瘤組織中iNOS mRNA表達增加（P<0.05）。
　　(4)與PBS對照組相比，Western-blot檢測發(fā)現經IL-17處理后的荷瘤小鼠脾臟MDSCs中ERK1/2磷酸化水平、BCL-2表達水平明顯上調（P<0.05）；ARG-1活性明顯增強（P<0.05）。體外培養(yǎng)24h后， PBS對照組活細胞比例為（44.23±3.477）

10、%，IL-17處理組為（59.33±2.718）%（P<0.05）；PBS對照組晚期凋亡細胞比例為（33.28±4.104）%，IL-17處理組為（19.26±2.494）%（P<0.05）。
　　(5)與對照組相比，過繼轉移經U0126處理的MDSCs后，脾臟和腫瘤組織中MDSCs分別減少了3.6%（P<0.05）、5.3%（P<0.01），腫瘤體積減小，腫瘤重量減輕（對照組為2.948±0.7537g，U0126處理組為0.7

11、830±0.1597g）（P<0.05），腫瘤組織中Ki67mRNA（P<0.01）、iNOSmRNA的相對表達水平降低（P<0.05），脾臟分離出的MDSCs經培養(yǎng)后，凋亡水平明顯增加，BCL-2表達量明顯減少（P<0.001）。
　　結論：
　?。?） IL-17在體外能夠通過增強ERK1/2分子的磷酸化抑制MDSCs的凋亡
　　（2） IL-17能通過抑制MDSCs的凋亡和增強其免疫抑制活性促進腫瘤的生長。IL-