IL-17對(duì)NSCLC淋巴管生成及其預(yù)后影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)預(yù)后差,5年生存率低于15％,其原因在于NSCLC極易發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。近年的研究表明,腫瘤微環(huán)境中的炎癥浸潤和脈管形成是腫瘤惡性進(jìn)展的重要因素。白介素-17(IL-17)是新近發(fā)現(xiàn)的一類前炎癥因子,分泌IL-17的CD4+T細(xì)胞稱為Th17(interleukin17-producing T helper cells

2、)細(xì)胞,在腫瘤微環(huán)境中起決定免疫效應(yīng)方向的重要作用。目前越來越多的證據(jù)表明IL-17陽性細(xì)胞存在于多種炎癥相關(guān)性腫瘤中,包括前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌和NSCLC。不少實(shí)驗(yàn)證明IL-17可促進(jìn)腫瘤血管生成,并在人原位卵巢癌、肝癌和NSCLC中發(fā)現(xiàn)IL-17與血管密度相關(guān)。然而,也有一些實(shí)驗(yàn)表明IL-17可促進(jìn)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)。因此,關(guān)于IL-17在NSCLC預(yù)后中的作用仍不甚清楚;IL-17雖然被證明可促進(jìn)腫瘤

3、血管生成,但其與另一脈管形成過程--淋巴管生成的關(guān)系卻少有研究。
　　 進(jìn)一步研究表明,IL-17的胞內(nèi)信號(hào)通路與IL-1和Toll樣受體相似,而IL-1β可以促進(jìn)靶細(xì)胞內(nèi)VEGF-C的表達(dá):另一方面,IL-17可以促進(jìn)靶細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等細(xì)胞因子。因此,我們有理由進(jìn)一步推測(cè):IL-17可能通過促進(jìn)NSCLC細(xì)胞分泌VEGF-C加強(qiáng)淋巴管生成,從而

4、促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。
　　 目的：
　　 闡明IL-17對(duì)NSCLC淋巴管生成及其預(yù)后的影響,探討其具體機(jī)制。
　　 方法
　　 1.應(yīng)用連續(xù)切片觀察IL-17與CD4、CD8(T細(xì)胞表面標(biāo)志)、CD68(巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志)的共表達(dá),以鑒定IL-17的細(xì)胞來源。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-17蛋白在52例NSCLC組織中的表達(dá),并分析IL-17表達(dá)與腫瘤臨床病理特征、淋巴管生成及預(yù)后的關(guān)系。
　　 2

5、.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-17、VEGF-C、淋巴管密度(lymphatic vessel density,IND)在36例NSCLC組織中的表達(dá),卡方檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)分析IL-17、VEGF-C與LVD之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 3.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-17對(duì)淋巴管內(nèi)皮(lymphatic endothelial cells,LECs)細(xì)胞生長的影響,Transwell實(shí)驗(yàn)和管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)分析IL-17作用于Lewis肺癌細(xì)胞(le

6、wis lungcarcinoma cell,LLC)的條件培養(yǎng)基對(duì)LEC細(xì)胞遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成的影響。流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)LLC和LEC的IL-17R的表達(dá)。
　　 4.以Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)為主要體外模型,應(yīng)用定量RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)IL-17刺激LLC表達(dá)VEGF-C mRNA和蛋白的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。Westernblotting檢測(cè)IL-17刺激A549細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2的情況,用p-ERK1

7、/2特異性阻斷劑PD98059阻斷p-ERK1/2的激活,觀察IL-17上調(diào)VEGF-C表達(dá)是否受到抑制,明確p-ERK1/2 MAPK信號(hào)通路在調(diào)控IL-17介導(dǎo)的VEGF-C上調(diào)表達(dá)中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.52例NSCLC患者的組織切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn),25例NSCLC組織表達(dá)IL-17(25/52,48.1％)。大部分IL-17陽性細(xì)胞表現(xiàn)出典型的T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的形態(tài)特征;CD4、CD8陽性細(xì)胞部分

8、與IL-17陽性細(xì)胞位置一致。IL-17與腫瘤生物學(xué)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):IL-17表達(dá)陽性的患者表現(xiàn)出腫瘤進(jìn)展的臨床病理特征;高表達(dá)IL-17狀態(tài)與吸煙狀態(tài)和TNM分期相關(guān),而與年齡、性別、分化程度和病理學(xué)分型無關(guān);IL-17陽性表達(dá)患者的無病生存期(disease free survival,DFS)和總生存期(overall survival,OS)顯著低于IL-17陰性表達(dá)的患者,提示IL-17表達(dá)與患者預(yù)后差相關(guān)。單因素和多因素分

9、析進(jìn)一步表明,腫瘤內(nèi)的IL-17的表達(dá)是DFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因子。
　　 2.檢測(cè)36例NSCLC石蠟切片內(nèi)LND、VEGF-C表達(dá)與瘤內(nèi)IL-17表達(dá)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)IL-17陽性表達(dá)患者的IND(11.1±5.3)高于IL-17陰性患者(5.8±4.2)(P＜0.01);IL-17表達(dá)與VEGF-C的表達(dá)具有相關(guān)性(P＜0.01)。
　　 3.IL-17對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)的增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成沒有直接作用;

10、但是相對(duì)于LLC培養(yǎng)上清,LLC/IL-17條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)LEC的遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成(P＜0.05)。
　　 4.外源性IL-17可顯著增加LLC細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)。LLC細(xì)胞經(jīng)用不同濃度的IL-17作用3h,VEGF-C mRNA表達(dá)呈劑量依賴性增加,其表達(dá)在IL-17濃度為10,100ng/ml時(shí)與對(duì)照組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并在IL-17濃度為10ng/ml時(shí)達(dá)到峰值,為對(duì)照組的1.40±0.17倍(P＜0.0

11、5)。LLC細(xì)胞經(jīng)用10ng/ml的IL-17作用48h,VEGF-C蛋白表達(dá)量與對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(203.0±13.1 vs277.3±14.0,P＜0.05)。A549細(xì)胞用IL-17刺激后,可見VEGF-C表達(dá)上調(diào)和p-ERK1/2激活,提前給予p-ERK1/2特異性抑制劑PD98059可抑制IL-17介導(dǎo)的VEGF-C表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.人NSCLC組織中IL-17的表達(dá)是肺癌預(yù)后的獨(dú)

12、立危險(xiǎn)因子,其IL-17主要來源于T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。
　　 2.IL-17與人肺癌組織IND和VEGF-C表達(dá)成正相關(guān),可能通過促進(jìn)VEGF-C表達(dá)促進(jìn)了淋巴管生成。
　　 3.IL-17對(duì)LEC的增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成沒有直接的促進(jìn)作用,但I(xiàn)L-17作用于LLC細(xì)胞之后的上清可以促進(jìn)LEC的遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成,這與LEC上不表達(dá)IL-17R但LLC表達(dá)IL-17R.有關(guān),提示IL-17可通過對(duì)NSCLC細(xì)胞的作用而