伊曲康唑?qū)盒孕厍环e液裸鼠淋巴管生成的影響.pdf

1、背景與目的:
　　 非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的首要原因。超過(guò)15％的非小細(xì)胞肺癌病人診斷之初已經(jīng)并發(fā)了惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)，并且隨著病情的進(jìn)展，50％以上的病人將并發(fā)惡性胸腔積液。惡性胸腔積液是肺癌病人較差預(yù)后的標(biāo)志之一，直至目前我們對(duì)惡性胸腔積液病因及其具體機(jī)制的了解還存在很多的不足。一般認(rèn)為腫瘤

2、所致惡性胸腔積液是由以下幾條途徑產(chǎn)生的:①淋巴系統(tǒng)引流障礙，此類(lèi)積液常為漿液性或乳糜性，而非血性。②胸膜的轉(zhuǎn)移性病變或原發(fā)腫瘤及伴有炎癥致毛細(xì)血管通透性增高引起，此類(lèi)積液多為血性。③腫瘤患者因營(yíng)養(yǎng)不良所致低蛋白血癥引起的漏出性胸腔積液。④癌栓脫落引起肺栓塞可引起胸腔積液。⑤胸內(nèi)腫瘤接受治療時(shí)對(duì)胸膜造成的刺激或損傷。⑥部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在惡性胸

3、腔積液產(chǎn)生中起到很重要的作用。
　　 盡管惡性腫瘤的治療手段在進(jìn)步，但是總體來(lái)說(shuō)目前為止惡性胸腔積液治療方法比較有限，治療效果不盡如人意。臨床上惡性腫瘤患者一旦并發(fā)了惡性胸腔積液，即說(shuō)明其病變已到晚期。惡性胸腔積液增長(zhǎng)迅速，常伴有胸悶、氣急、心悸等癥狀，如不及時(shí)治療可造成患者呼吸循環(huán)功能障礙、低蛋白血癥、貧血，甚至危及生命。不斷增多的積液量使肺擴(kuò)張受到了限制，因而能?chē)?yán)重影響心肺功能，并且易并發(fā)肺不張和反復(fù)感染。確診惡性胸腔積液后

4、，一般患者的生存時(shí)間小于六個(gè)月。因此，惡性胸腔積液治療的主要目的在于有效地控制積液量的增長(zhǎng)，緩解病人的呼吸困難癥狀，提高病人生活質(zhì)量，進(jìn)一步延長(zhǎng)生存期。因而，迅速有效的抑制惡性胸腔積液的增長(zhǎng)是整個(gè)腫瘤治療中環(huán)節(jié)中的重中之重。
　　 1627年，Asellius首次發(fā)現(xiàn)了淋巴系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)幾個(gè)世紀(jì)的研究，目前人們對(duì)淋巴管的結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)已逐步深入。與毛細(xì)血管相比，毛細(xì)淋巴管的管腔相對(duì)較大且不規(guī)則，管壁較薄，僅由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，基底膜不

5、連續(xù)，內(nèi)皮間隙開(kāi)放，管周通過(guò)網(wǎng)狀纖維和膠原組織與細(xì)胞外基質(zhì)相連;內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度拉伸可使管壁變得更薄，從而形成淋巴管特有的高通透性。惡性腫瘤的淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(Vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)的高表達(dá)有關(guān)。VEGF-C的特異性酪氨酸激酶受體VEGFR-3(Vascularendothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)

6、主要表達(dá)于淋巴管的上皮細(xì)胞內(nèi)，且VEGF-C主要通過(guò)與VEGFR-3的結(jié)合，來(lái)誘導(dǎo)瘤內(nèi)和瘤旁淋巴管形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這也是大部分腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑。在胸膜轉(zhuǎn)移瘤中，腫瘤細(xì)胞分泌較多的VEGF-C，致使腫瘤淋巴管生成及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增多，且新生的淋巴管管腔較脆，較之正常淋巴管更易于破裂，導(dǎo)致淋巴液滲漏形成惡性胸腔積液。癌細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，經(jīng)淋巴結(jié)進(jìn)入淋巴循環(huán)，聚集成團(tuán)堵塞淋巴管，導(dǎo)致淋巴引流障礙。另一方面，腫瘤新生淋巴管管腔迂曲，內(nèi)皮細(xì)

7、胞間隙增大，易于腫瘤細(xì)胞沿淋巴管的轉(zhuǎn)移及管腔內(nèi)淋巴液的滲漏。上述也是惡性胸腔積液形成的兩個(gè)重要原因。
　　 多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)伊曲康唑(Itraconazole)具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，在基質(zhì)膠轉(zhuǎn)移瘤模型中伊曲康唑具有抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用。眾所周知，腫瘤血管新生與淋巴管新生具有相似的途徑，且二者共同參與了惡性胸腔積液的形成。但伊曲康唑是否同時(shí)具有抑制淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用，進(jìn)而達(dá)到治療惡性胸腔積液的目的，目前國(guó)

8、內(nèi)外關(guān)于此項(xiàng)研究的報(bào)道極少。本研究擬用經(jīng)胸腔注射腫瘤細(xì)胞的方式來(lái)建立荷瘤惡性胸腔積液裸鼠模型。成功建模后應(yīng)用不同劑量的伊曲康唑經(jīng)胸膜腔內(nèi)局部注射方式來(lái)處理惡性胸腔積液小鼠，并設(shè)立空白對(duì)照組來(lái)觀(guān)察伊曲康唑?qū)盒孕厍环e液的作用以及其對(duì)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成方面的作用，以期為今后惡性胸腔積液的抗淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移治療提供一定的理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 第一部分裸鼠惡性胸腔積液模型的建立
　　 本研究利

9、用GFP-LLC(green fluorescent protein-Lewis lung cancer)肺癌細(xì)胞，取其生長(zhǎng)狀態(tài)良好者懸浮至磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS）中，調(diào)整濃度至1×10(^)6/50μl，經(jīng)胸腔注射的方式構(gòu)建肺癌細(xì)胞惡性胸腔積液裸鼠模型，共30只裸鼠。接種細(xì)胞后每天觀(guān)察小鼠的生命體征、腫瘤生長(zhǎng)。接種腫瘤細(xì)胞后第4天開(kāi)始，每3天處死2只小鼠，解剖后先后在近紅外熒光顯微鏡

10、和肉眼狀態(tài)下觀(guān)察小胸腔腫瘤形成情況，并計(jì)量小鼠胸腔積液體積。從接種腫瘤細(xì)胞后第7天開(kāi)始，每7天給予小鼠一次胸部CT掃描，觀(guān)察小鼠胸腔積液形成情況。
　　 第二部分伊曲康唑?qū)盒孕厍环e液裸鼠淋巴管生成的影響
　　 選取30只4-6周齡的裸鼠，動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組10只，按前述造模方法建立荷瘤裸鼠胸腔積液模型。建模后第4天開(kāi)始，治療組分別經(jīng)胸膜腔注射25mg/kg的高劑量伊曲康唑(high dose of itracona

11、zole，H-ITCZ)，8mg/kg低劑量伊曲康唑（low dose of itraconazole， L-ITCZ），對(duì)照組則胸腔注射50ul羥丙基β-環(huán)糊精(Hydroxypropylβ-cyclodextrin，H-β-C，130mg/ml)溶液。所有實(shí)驗(yàn)裸鼠每3日經(jīng)胸腔注射一次藥物，共持續(xù)4次。在GFP-LLC細(xì)胞接種后第14天，所有小鼠經(jīng)腹腔注射麻醉后行胸部CT檢查，以觀(guān)察胸腔積液形成情況。在GFP-LLC細(xì)胞接種后第16天

12、，全部小鼠麻醉處死解剖后，用1ml注射器經(jīng)小鼠縱膈以開(kāi)窗方式抽取胸腔積液，分別計(jì)量各組胸水平均體積。胸腔積液離心后上清-80℃保存，備用。上清行ELISA法檢測(cè)胸腔積液中VEGF-C濃度。胸腔積液離心沉渣行改良Gimsa法染色，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞類(lèi)型。小鼠解剖抽吸胸水先后在近紅外熒光顯微鏡(Near-infrared fluorescence microscopy，NIRfluorescence microscopy)和自然光下拍照，分

13、別觀(guān)察小鼠胸腔、胸壁及縱膈等表面的腫瘤結(jié)節(jié)，同時(shí)觀(guān)察腫瘤結(jié)節(jié)的綠色熒光表達(dá)情況，計(jì)數(shù)腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量。取腫瘤組織標(biāo)本部分行HE(hematoxylin and eosin)染色，剩余標(biāo)本福爾馬林液中保存24小時(shí)，蠟封及切片后行免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）染色，觀(guān)察腫瘤組織淋巴管中微淋巴管密度（microlymphat ic vessel density，MLVD）和VEGF-C的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果

14、:
　　 第一部分經(jīng)胸腔種植腫瘤細(xì)胞的方式可建立惡性胸腔積液裸鼠模型
　　 小鼠接種腫瘤細(xì)胞后第4天開(kāi)始，近紅外熒光成像系統(tǒng)下可發(fā)現(xiàn)小鼠胸腔內(nèi)散在少量熒光。隨著小鼠接種腫瘤的時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，小鼠胸腔腫瘤體積逐漸增加，腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)逐漸增多。小鼠胸部CT檢查結(jié)果提示:第7天、第14天和第21天小鼠的成胸水率分別為28％、74％和81％。小鼠平均生存時(shí)間為16.7天.解剖后見(jiàn)小鼠所有胸腔積液均為血性，靜止后不凝固，胸腔積液平均體積

15、在第10天以后逐漸增加并在第16天達(dá)到峰值，約為0.5ml。
　　 第二部分伊曲康唑可抑制惡性胸腔積液裸鼠淋巴管生成
　　 小鼠胸部CT檢查結(jié)果提示高濃度伊曲康唑組胸腔積液不明顯，僅有少量。低濃度伊曲康唑組和羥丙基β-環(huán)糊精組可見(jiàn)明顯胸腔積液，其中羥丙基β-環(huán)糊精組胸腔積液最為明顯，小鼠右側(cè)胸腔可見(jiàn)大量積液。在GFP-LLC細(xì)胞接種后第16天處死全部小鼠后經(jīng)縱膈開(kāi)窗抽取胸腔積液，所有積液均為血性，靜止后不凝固。高濃度伊曲

16、康唑組、低濃度伊曲康唑組和羥丙基β-環(huán)糊精組小鼠平均胸水體積分別為311.19±27.20ul、445.64±27.75ul、575.76±32.61ul。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高濃度伊曲康唑處理組小鼠胸水量最少，提示隨著伊曲康唑藥物濃度的增高，伊曲康唑?qū)盒孕厍环e液生成的抑制作用愈加明顯。高濃度伊曲康唑組與低濃度伊曲康唑組及對(duì)照組胸水差異分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。小鼠解剖后充分暴露胸腔和腹腔，自然光下可見(jiàn)小鼠胸腔腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移，遍及臟、

17、壁層胸膜，縱膈亦可見(jiàn)大量淋巴結(jié)及腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，與近紅外熒光顯微鏡下所見(jiàn)小鼠胸腔轉(zhuǎn)移瘤情況類(lèi)似。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，近紅外熒光照片對(duì)小鼠胸腔微小轉(zhuǎn)移灶顯像更加清晰，易于辨認(rèn)。計(jì)數(shù)小鼠胸腔腫瘤結(jié)節(jié)結(jié)果示，羥丙基β-環(huán)糊精組、低濃度伊曲康唑組和高濃度伊曲康唑組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量分別為27.40±3.92、21.40±3.37和11.55±3.28。高濃度伊曲康唑組和低濃度伊曲康唑組及羥丙基β-環(huán)糊精組腫瘤結(jié)節(jié)差異分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且低濃

18、度伊曲康唑組與羥丙基-β環(huán)糊精組之間也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明隨著伊曲康唑藥物濃度的提高，小鼠胸腔腫瘤轉(zhuǎn)移灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)量均減少，這進(jìn)一步證實(shí)了伊曲康唑能抑制腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。胸腔積液上清行ELISA法檢測(cè)VEGF-C結(jié)果提示，隨著伊曲康唑藥物濃度的提高，胸腔積液中VEGF-C的表達(dá)逐漸減少。腫瘤組織病理染色結(jié)果提示小鼠胸腔腫瘤細(xì)胞核大，染色深，排練紊亂，為腺癌細(xì)胞系。腫瘤組織行免疫組化染色鑒定腫瘤微淋巴

19、管密度(MLVD)結(jié)果示:羥丙基β-環(huán)糊精組、低濃度伊曲康唑組和高濃度伊曲康唑組微淋巴管密度分別為24.1±2.51，20.5±1.58和14.1±1.45，各組間分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。VEGF-C陽(yáng)性率:羥丙基β-環(huán)糊精組、低濃度伊曲康唑組和高濃度伊曲康唑組的陽(yáng)性率分別為65％，47％，36％，.治療組與對(duì)照組之間都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功建立了經(jīng)胸腔注射腫瘤細(xì)