HMGB1對結腸癌組織淋巴管生成的影響及其機制研究.pdf

1、背景與目的 侵襲轉移是惡性腫瘤的基本特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因之一。淋巴道是大部分腫瘤最常見的轉移途徑，有無淋巴結轉移也是判斷患者預后的重要指標。近年來隨著淋巴管標記物以及淋巴管生成因子的發(fā)現，文章報道腫瘤細胞可通過自分泌或旁分泌內皮細胞生長因子C/D(VEGF-C/D)，誘導腫瘤淋巴管生成，增加腫瘤淋巴道轉移的幾率。結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，淋巴道轉移是其最常見的轉移方式。因此了解結腸癌淋巴管生成情況及其影響干

2、預因素，對加深其淋巴道轉移機制的理解和今后的治療都有相當重要的意義。 高遷移率蛋白B1(HMGBl)最早發(fā)現可作為一種小分子量DNA結合蛋白在轉錄調節(jié)中發(fā)揮重要作用。近年來發(fā)現它不僅可作為轉錄調節(jié)因子，還可以在細胞外發(fā)揮作用。通過與其受體晚期糖基化終產物受體(RAGE)結合，在炎癥，細胞遷移、分化，腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用。在體內，HMGB1主要來自損傷或壞死細胞，或被缺氧、內毒素、TNF-α、IL-1β等因素活化的巨

3、噬細胞。通過活化的巨噬細胞分泌的HMGB1可再度激活巨噬細胞，使其分泌VEGF、TNF-α、IL-8等多種細胞因子。而據報道VEGF-C/D的表達與多種炎癥因子有關。 已有研究報道HMGB1在腫瘤血管生成方面有一定的影響，而在淋巴管生成方面則未見相關研究。因此，我們擬通過檢測HMGB1對結腸癌組織淋巴管生成因子VEGF-C/D表達的影響及其機制的研究，了解其是否對結腸癌的淋巴管生成，淋巴結轉移產生影響，從而對結腸癌發(fā)生淋巴道轉移

4、的機制進行初步探討。 研究方法 首先，通過免疫組化的方法，檢測結腸癌組織中HMGB1、VEGF-C/D的表達情況，同時利用統計學方法，分析HMGB1表達同VEGF-C/D表達、淋巴管計數、淋巴結轉移情況以及其他一些臨床病理特征的相關性。 其次，體外培養(yǎng)結腸癌細胞、單核巨噬細胞，并以HMGB1作為刺激因子，通過RT-PCR、western blot等方法，檢測其對兩種細胞VEGF-C/D表達的影響。并針對在胞外，H

5、MGB1主要通過其受體RAGE來激活多種細胞通路的情況，構建NF-κB干擾載體，通過比較HMGB1對干擾組細胞和對照組細胞的VEGF-C/D表達的影響，分析判斷HMGB1對VEGF-C/D表達影響的通路。最后，構建HMGB1表達載體，并轉染結腸癌細胞HCT116，篩選HMGB1高表達細胞。采用背部皮下種植的的方法造成裸鼠荷瘤模型。比較轉染組與對照組種植瘤在淋巴管生成、淋巴結轉移方面的差異。 結果 在結腸癌組織切片免疫組化

6、檢測中，可觀察到HMGB1表達于癌細胞和巨噬細胞。在70例標本中，陽性率72.9％；有淋巴結轉移的患者與無轉移的患者之間，HMGB1的陽性率差異顯著(P<0.05)。VEGF-C/D也表達于癌細胞及巨噬細胞的細胞質。在腫瘤周圍正常組織中則基本沒有表達。二者中以VEGF-C表達多見。淋巴結轉移患者的VEGF-C陽性率高于無淋巴結轉移的患者的陽性率，差異有統計意義。結腸癌組織中HMGB1和VEGF-C/D的表達在病人的年齡、性別、分化程度等

7、方面差異不顯著(P>0.05)。通過免疫組化雙染觀察到結腸癌相關巨噬細胞可同時表達HMGB1、VEGF-C/D，而且經統計分析，發(fā)現HMGB1、VEGF-C/D的表達及巨噬細胞計數三者之間存在相關性(P<0.05)。結腸癌組織中淋巴管計數也與HMGB1、VEGF-C有關。 在體外實驗中，通過不同濃度與時間的HMGB1刺激，經檢測mRNA與蛋白表達的改變。發(fā)現VEGF-C的表達與HMGB1呈量效關系。在作用時間上，VEGF-C表達

8、增強在HMGB1刺激后12小時達高峰，而VEGF-D則在4小時就達峰值。在轉染NF-κB干擾載體后，發(fā)現可抑制HMGB1對VEGF-C/D的誘導作用。由此可推測HMGB1與受體結合后可通過活化NF-κB途徑來誘導VEGF-C/D的表達。 在動物體內實驗中，成功構建了HMGB1表達載體并順利轉染HCT116細胞。轉染HMGB1的HCT116細胞裸鼠移植瘤與對照組移植瘤相比較，生長相同天數后，轉染組淋巴管計數多于未轉染組，并有統計學

9、意義。 結論 本文通過研究結腸癌組織中HMGB1對VEGF-C/D表達的影響及其機制。認為(1)結腸癌組織中HMGB1及VEGF-C/D表達于多種細胞(結腸癌細胞、腫瘤相關巨噬細胞)，并且和腫瘤淋巴管生成、淋巴結轉移存在相關性。(2)HMGB1可誘導VEGF-C/D在結腸癌細胞和單核巨噬細胞中的表達。(3)HMGB1在與受體結合后可通過NF-κB影響到VEGF-C/D的表達。(4)hMGB1可通過影響腫瘤局部微環(huán)境中VE