抗原致敏、基因修飾的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免疫殺傷多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U-,266-的研究.pdf

1、研究背景：多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種低增殖活性和低凋亡活性的克隆性疾病，因其緩解率低，復(fù)發(fā)率高，用傳統(tǒng)化療不能治愈而困擾著臨床。目前采用的常規(guī)化療不能從根本上延長患者的無病生存期(DFS)及總生存期(OS)。微小殘留病(MRD)常是化療耐藥和復(fù)發(fā)的主要原因，因此迫切需要有新的治療策略。正因?yàn)槿绱巳藗儗γ庖咧委熂挠韬裢?。希望在化療基礎(chǔ)上結(jié)合適當(dāng)?shù)拿庖咧委熌軌蚋鼜氐椎厍宄齅RD，進(jìn)而達(dá)到痊愈。腫瘤的免疫治療自80年代以后有了飛躍的發(fā)展，其中

2、，以抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTLs)介導(dǎo)的腫瘤免疫治療成為新的熱點(diǎn)。MM細(xì)胞本身可表達(dá)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)性抗原，適于進(jìn)行免疫冶療。粒．巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種在抗原提呈細(xì)胞(APC)的成熟和功能發(fā)揮中起重要作用的細(xì)胞因子，它能夠維持樹突狀細(xì)胞(DCs)成熟，增強(qiáng)DCs抗原捕獲能力及促進(jìn)共刺激分子的表達(dá)。因此，我們設(shè)想通過體外擴(kuò)增健康人濃縮白細(xì)胞的DCs，然后以多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266可溶性抗原沖擊致敏DCs

3、，并通過腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)GM-CSF基因到DCs細(xì)胞中，以誘導(dǎo)U266抗原特異性CTLs，為基因工程技術(shù)輔助免疫治療MM打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的：研究負(fù)載有U266可溶性抗原并攜帶外源基因GM-CSF的DCs，在體外激活自身T細(xì)胞形成CTLs對U266細(xì)胞的殺傷作用。 方法：利用淋巴細(xì)胞分離液從健康人的外周血濃縮白細(xì)胞中分離出單個核細(xì)胞(PBMC)，然后通過貼壁法得到單核細(xì)胞。所得的單核細(xì)胞應(yīng)用GM-CSF和IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，

4、到第7天加TNF-a誘導(dǎo)成熟。通過光鏡、透射電鏡觀察DCs形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs白細(xì)胞免疫標(biāo)記，ELISA檢測DCs的IL-12分泌情況，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)研究DCs免疫激活功能等生物學(xué)特性；用含有外源基因GM-CSF的腺病毒反復(fù)感染293細(xì)胞，以擴(kuò)增病毒滴度；用U266可溶性抗原致敏DCs，再用含有外源基因GM-CSF的腺病毒感染DCs，將所得的DCs與T細(xì)胞混合培養(yǎng)5天，以形成對U266具有特異殺傷作用的CTLs，最后通過測定LD

5、H以計(jì)算CTLs對U266的殺傷率，并用ELISA法檢測特異性CTLs的IFN-7分泌情況。 結(jié)果：所分離出的單核細(xì)胞，在GM-CSF、IL-4和TNF-a細(xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)下可誘導(dǎo)形成具有典型特征的DCs。除了CD80，其它分化抗原CD83、CD86、HLA-DR表達(dá)量較高，并低表達(dá)分化抗原CDl4。隨著DCs的成熟，培養(yǎng)液中的的IL．12濃度逐漸升高。所誘導(dǎo)的成熟DCs，較少的細(xì)胞數(shù)就能夠刺激同種自體T淋巴細(xì)胞增殖。通過對LD

6、H的測定，可得出各組對U266的殺傷率為：當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為5：l時(shí)，未加抗原未感染病毒組(N-DC)的殺傷率為2．6~／~1．5％，加抗原未感染病毒組(U-DC)為¨3％±2．6％，加抗原感染病毒組(G-U-DC)為21．2％士1．8％；當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為10：1時(shí)，N-DC組的殺傷率為3．9％士0．8％，U-DC組為28．1％士3．2％，G-U-DC組為41．3％士2．9％；當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為20：l時(shí)，N-

7、DC組的殺傷率為5．0％-4：0．4％，U-DC組為40．5％4-7．7％，G-U-DC組為62．6~／~4．7％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSSll．5分析，三組(G-U-DC、U-DC和N-DC組)之間的殺傷率存在顯著差異(n=3，F(xiàn)=10．939，P<0．05)，通過兩兩比較，得出G-U-DC組的殺傷率高于其它兩組(P<0．001)，且U-DC組高于N-DC組(P