HPV-E6E7基因轉(zhuǎn)染人樹突狀細(xì)胞抗食管癌體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:本研究旨在分離人臍帶血來(lái)源的CD34+干細(xì)胞并在體外分化擴(kuò)增為成熟的功能性樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)的過(guò)程,并以HPV16E6/18E7基因轉(zhuǎn)染 DC制備DC疫苗,檢測(cè)其生物學(xué)特性;觀察并測(cè)定其在體外誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)活性,同時(shí)觀察其對(duì)經(jīng)免疫重建的SCID小鼠體內(nèi)食管癌生長(zhǎng)的免疫防治效應(yīng)。
　　方法:1.應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒提取 pcDN

2、A3.1-HPV16E6/18E7質(zhì)粒,分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度,然后通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DMRIE-C將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入經(jīng)rhGM-CSF、rhTNF-α體外聯(lián)合誘導(dǎo)12天的人臍血來(lái)源CD34+干細(xì)胞,制備負(fù)載 HPV16E6/18E7基因的DC疫苗,倒置顯微鏡下觀察并以流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前、后其表面分子CD80、CD86、CD83及轉(zhuǎn)染后E6/E7蛋白的表達(dá)情況。
　　2.斑點(diǎn)雜交法測(cè)定食管癌細(xì)胞EC-109的HPV類型。3.體

3、外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)采用MTT法,檢測(cè)HPV18E7-DC疫苗誘導(dǎo)的人外周血CTL對(duì)食管癌細(xì)胞EC-109的殺傷活性。4.HPV16E6/18E7-DC疫苗小鼠腹腔內(nèi)注射2次,間隔3d,70d后檢測(cè)疫苗是否具有致瘤性。5.按隨機(jī)數(shù)字法將SCID小鼠隨機(jī)分為免疫保護(hù)組和免疫治療組。免疫保護(hù)組隨機(jī)分成C、Im-T、Im-16D和Im-18D四小組,分別用PBS、T細(xì)胞、HPV16E6-DC+T細(xì)胞、HPV18E7-DC+T細(xì)胞免疫接種后,再接種EC

4、-109細(xì)胞;免疫治療組分成 C、Tr-T、Tr-16D和Tr-18D四小組,分別以 PBS、T細(xì)胞、HPV16E6-DC+T細(xì)胞和HPV18E7-DC+T細(xì)胞對(duì)EC-109荷瘤小鼠進(jìn)行免疫治療。以誘發(fā)小鼠腫瘤的潛伏期和腫瘤的體積、重量、生長(zhǎng)速度等為觀察指標(biāo),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以探討 HPV16E6/18E7-DC疫苗對(duì)食管癌細(xì)胞株EC-109體內(nèi)生長(zhǎng)的免疫保護(hù)和免疫治療效應(yīng)。
　　結(jié)果:1.50ml臍帶血可分離出 CD34+干細(xì)

5、胞約1.0×106,臺(tái)盼藍(lán)染色95％以上不顯色;在rhGM-CSF和rhTNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)下,14天后CD34+干細(xì)胞約擴(kuò)增10-20倍,DC的純度達(dá)90%以上。CD34+干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸形成細(xì)胞集落,集落逐日增多增大,并在第8-9天達(dá)到最大,此后集落逐漸減少變小,并脫落成具有典型樹枝狀突起的成熟DC。表面分子CD80、CD86、CD83表達(dá)陽(yáng)性率分別為65.5%、65.9%和80.7%。HPV16E6/18E7基因轉(zhuǎn)染后 DC生

6、長(zhǎng)良好,流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表面分子CD80、CD86、CD83表達(dá)陽(yáng)性率分別為81.6%、80.5%和86.6%,目的基因蛋白E6、E7表達(dá)率分別為38.6%和47.5%。2.斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞EC-109的病毒類型為HPV18型。3. HPV18E7-DC疫苗致敏的外周血CTL對(duì)食管癌細(xì)胞EC-109的殺傷活性明顯高于DC組致敏的CTL及T組和C組(P<0.01),且隨效靶比的增高而增強(qiáng)(P<0.05)。DC致敏的CTL的殺

7、傷活性與T組比較也有顯著性差異(P<0.05)。
　　4.致瘤性研究顯示腹腔注射HPV16E6/18E7-DC疫苗的小鼠均未發(fā)生腫瘤。5.在免疫保護(hù)組,Im-16D和Im-18D組腫瘤的生長(zhǎng)速度減慢,腫瘤潛伏期較C組和Im-T組明顯延長(zhǎng)(P<0.01),腫瘤體積和腫瘤重量均明顯小于C組和Im-T組(P<0.01),Im-16D和Im-18D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在免疫治療組,Tr-16D和Tr-18D腫瘤體積和腫

8、瘤重量均明顯小于C組和Tr-T組(P<0.01),Tr-16D和Tr-18D比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:1.以免疫磁珠法從人臍帶血中分離CD34+干細(xì)胞,在體外經(jīng)rhGM-CSF和rhTNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)14天,可分化擴(kuò)增出大量高純度、形態(tài)功能成熟的DC,此方法操作簡(jiǎn)便,分離細(xì)胞量大、純度高,具有巨大的實(shí)用價(jià)值。2.使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將 HPV-E6E7基因轉(zhuǎn)入 DC,細(xì)胞生長(zhǎng)良好,并且目的基因在DC內(nèi)高表達(dá),說(shuō)

9、明DC疫苗構(gòu)建成功,陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以安全、有效的介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入DC,為DC疫苗的構(gòu)建做了有益探索。3. HPV18E7-DC疫苗在體外能誘導(dǎo)出高效的特異性CTL,對(duì)表達(dá)HPV18的食管癌EC-109細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的特異性殺傷效應(yīng)。4.HPV16E6/18E7-DC疫苗無(wú)體內(nèi)致瘤性,安全可靠。5. HPV16 E6/18E7-DC疫苗能顯著抵抗EC-109細(xì)胞對(duì)小鼠的攻擊,并能顯著抑制荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng),具有高效而顯著的免疫保護(hù)和免疫治療