分子腫瘤學6端粒、端粒酶與腫瘤

1、分子腫瘤學第七節(jié) 端粒、端粒酶與腫瘤,,細胞是有壽命的。細胞學家Hayflick發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)人體的成纖維細胞，在營養(yǎng)充分供給的情況下，細胞分裂到50代左右就停止活動了，真正地進入衰老期，這一發(fā)現(xiàn)似乎告訴人們在細胞內(nèi)有一口衰老鐘或細胞分裂鐘（mitotic clock)，這限定了細胞分裂的次數(shù)，也就限定了生物的壽命。 腫瘤細胞為什么具有永生的特性，它為什么可以不受限制的增殖？,研究顯示染色體端粒（telomere） 、端粒酶（t

2、elomerase）與動物及人類的衰老、惡性腫瘤發(fā)生有高度相關(guān)性，成為發(fā)育生物學、分子腫瘤學等眾多學科關(guān)注的焦點。人們期望能從中尋找出抗細胞衰老和治療腫瘤的新途徑。,端粒（telomere）是真核生物染色體的天然末端，是細胞必需的遺傳組分，因為它能夠補償染色體末端遺傳信息的丟失。早在1938年Muler用X射線處理果蠅，觀察和分析因射線輻射引起的染色體重組的頻率和類型時，發(fā)現(xiàn)染色體末端很少有缺失與倒位現(xiàn)象發(fā)生，便推斷在染色體的兩端一定

3、存在一種特殊的結(jié)構(gòu)并將它稱之為端粒。,一、端粒、端粒酶的發(fā)現(xiàn)與染色體 的末端復制機制,在復制過程中，染色體末端的堿基對會緩慢地丟失，隨著每一次的細胞分裂，染色體末端將丟失50~200個端粒核苷酸，所以在連續(xù)分裂中，染色體產(chǎn)生進行性縮短，致使末端功能喪失和染色體不穩(wěn)定，最終導致細胞衰老和死亡。Watton在1972年提出了染色體末端復制問題。,自然界中不同的生物有著各自巧妙的“策略”來解決DNA末端復制的難題。原核生物有的將自已

4、的DNA環(huán)化，新鏈的3’-OH端繼續(xù)向前延伸，這樣一來便可補上RNA引物被消除后所留下的空缺。有的通過形成多連體來達到完全復制。,一些具線性DNA的病毒，在長期的進化過程中，也恰當?shù)剡x擇了自已的末端復制策略。如細小病毒（pariovirns）在單股DNA末端有一個正向的反向的重復序列，這一回文片段能在末端形成發(fā)卡形結(jié)構(gòu)，使得合成新鏈折回補齊5’端缺失。腺病毒則有一種特殊的蛋白質(zhì)與5’端共價連接，并可作為腺病毒DNA復制的起始引物。

5、,真核生物的染色體 DNA末端復制,1985年Blackburn實驗室在四膜蟲中發(fā)現(xiàn)并純化了一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核酸蛋白酶，它能以自身的RNA為模板，通過另一組分即依賴于RNA的DNA多聚酶的活性在染色體末端添加端粒重復順序，當合成完畢時，該酶向遠處易位，再繼續(xù)合成新的重復序列延長的末端可以形成回文結(jié)構(gòu)，使得合成新鏈折回補齊5’端缺失，達到末端的完全復制，這就是真核生物的末端復制機制。 這種酶被稱為端粒酶。,二.

6、端粒的結(jié)構(gòu)、功能與 長度調(diào)節(jié)機制,1、端粒的結(jié)構(gòu) 端粒由規(guī)則或不規(guī)則的雙鏈重復序列和最末端的一條富含G的單鏈重復序列及端粒結(jié)合蛋白組成。端粒結(jié)合蛋白分為兩類：端粒單鏈結(jié)合蛋白和端粒雙鏈結(jié)合蛋白。前者在端粒末端提供帽狀結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定端粒；后者可能直接參與端粒長度平衡的維持，是端粒延伸的負調(diào)節(jié)因子。 對于一個特定的真核生物物種，它一定具有其特征性的端粒DNA序列和平均長度。研究結(jié)果表明，人類的端粒序列為[TTAG

7、GG]n，約5~20kb。,2、端粒的功能,端粒的功能主要在于維持染色體的穩(wěn)定性，此外，還參與核中的一系列活動。如：染色體定位，轉(zhuǎn)錄抑制，異染色質(zhì)形成，起細胞有絲分裂鐘的作用，介導染色體復制、引導減數(shù)分裂時的同源染色體配對等。,3、端粒長度的調(diào)節(jié)機制,改變端粒結(jié)構(gòu)會導致端粒酶活性失常，從而控制端粒的長度而DNA的不完全復制、端粒的加工和端粒的重組，則會引起端粒的縮短,端粒的延伸與無限增殖化細胞端粒長度維持機制有關(guān)：①端粒酶陽性途徑

8、（telomerase-positive pathway），這類細胞端粒酶呈陽性，端粒短。②端粒酶陰性途徑（telomerase-negative pathway），這類細胞端粒酶陰性，其端粒并不縮短。,三.端粒酶的結(jié)構(gòu)、功能及 活性調(diào)控與檢測,1、端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能 端粒酶是一種自身攜帶模板的反轉(zhuǎn)錄酶，在結(jié)構(gòu)上是一種核糖核蛋白（nuclear ribonuclear protein,RNP)復合物，由 RNA和蛋白質(zhì)亞

9、基組成。端粒酶的RNA 是合成端粒DNA的模板，人端粒酶RNA組分基因于1995年克隆，命名為hTR基因定位于三號染色體，約含450個堿基，包含5(CUAACCCUAAC)3具11個堿基的模板序列，每次與1.5個TTAGGG互補而特異地合成人染色體端粒的DNA。 hTR基因在所有體細胞中都有表達，因而hTR的表達不能說明端粒酶活性。,,其主要功能在于合成染色體端粒的重復序列，以維持端粒長度的穩(wěn)定性，端粒酶也能使斷裂染色體在原位形成端

10、粒。,2、端粒酶的活性、檢測與調(diào)控,端粒酶的活性：不同的細胞，同一細胞的不同狀態(tài)及某些物質(zhì)的協(xié)同作用都可影響到端粒酶的活性。對人體正常組織、多種良性病變及惡性腫瘤組織端粒酶活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)細胞分裂能力較強，分裂較快的組織端粒酶活性較高。胎兒時期的端粒酶有較高的活性，但在出生后不久，除生殖細胞和干細胞等少數(shù)細胞顯弱端粒酶活性外，端粒酶多處于失活狀態(tài)。絕大多數(shù)惡性腫瘤組織均顯示明顯的端粒酶活性。,端粒酶活性的檢測： 目前

11、常用的檢測方法有：同位素法、染色法、熒光法、ELISA法，也有報道用原位雜交方法檢測石蠟標本的端粒酶基因表達獲得與生化活性測定相一致的結(jié)果。 端粒重復序列擴增法（telomere repeat amplification protocol,TRAP)是將端粒延伸與PCR結(jié)合起來的方法，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了TRAP-ELISA法等,端粒酶活性的調(diào)控：,端粒酶活性的內(nèi)在調(diào)節(jié)端粒酶在正常人體細胞的失活與在惡性腫瘤細胞中的高表達，說

12、明體內(nèi)端粒酶調(diào)控機制的存在端粒重復結(jié)合因子（telomeric repeat binding factor,TRF)1和2是與端粒特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中TRF1是端粒長度的負向調(diào)控因子，其通過阻礙端粒酶與端粒的結(jié)合而發(fā)揮作用，而TRF2是端粒的保護因子。端錨酶（tankyrase,TRF1-interactin)是一種DNA核糖聚合酶，可與TRF1結(jié)合，把與端粒結(jié)合的TRF1從端粒上移開，從而使端粒酶發(fā)揮作用端粒酶的活性調(diào)控還與細

13、胞周期、細胞分化進程，細胞中蛋白磷酸化反應、凋亡調(diào)控基因如bcl-2、c-myc等的調(diào)控有關(guān)。雌、孕激素的水平的變化也參與了調(diào)節(jié)。人3號染色體上可能存在端粒酶的抑制基因，當將人3號染色體導入腎癌細胞株，則出現(xiàn)細胞端粒酶活性喪失，細胞失去無限制生長能力。,端粒酶活性的外在調(diào)節(jié)細胞中加入端粒酶RNA組份的反義寡核苷酸，使端粒酶的活性受到抑制；改變DNA的二級結(jié)構(gòu)或在細胞中加入陽離子卟啉，妨礙端粒酶與端粒結(jié)合，從而間接抑制端粒酶活性；使

14、用蛋白激酶(PKC)抑制劑抑制端粒酶的活性 ；通過破壞端粒酶的DNA錨著區(qū)，抑制端粒酶活性。,四.端粒、端粒酶與衰老的關(guān)系,人類細胞內(nèi)端粒酶活性的缺失將導致端?？s短，這種縮短使得端粒最終成為不能被細胞識別的末端。但這并不是說端粒不存在了，而是說端?？s短到了一個“關(guān)鍵長度”，端粒一旦短于此長度，就很有可能導致染色體雙鏈的斷裂，并激活細胞自身的檢驗系統(tǒng)，從而使細胞進入死亡危機狀態(tài)。,隨著端粒的進一步丟失，將會發(fā)生染色體重排、 雙著絲粒

15、染色體和非整倍染色體的形成等錯誤， 這將導致進一步的危機產(chǎn)生。,如果細胞試圖要維持其正常的分裂，那么就必須阻止端粒的進一步丟失，并且激活端粒酶。因為只有這樣細胞才能進行正常的染色體復制。因此，只有那些重新獲得端粒酶活性的細胞才能繼續(xù)生存下去。對于那些無法激活端粒酶（即無法阻止端粒進一步丟失）的細胞將只能面臨趨向衰老死亡的結(jié)果。,,,染色體DNA,端粒,端粒,（Kbp）

16、 干細胞 種系細胞端粒酶呈陽性 正常體細胞端粒酶呈陰性 M1 =5-7 轉(zhuǎn)化事件 M2 =2-4

17、 永生化腫瘤細胞端粒酶呈陽性 Hyflick極限期（M1） 危機期（M2）復 制 年 齡 端粒丟失與衰老關(guān)系模型,端粒限制性片斷長度,“端粒-端粒酶”假說基于端粒在細胞壽命中的作用，Harley提出了“端粒-端粒酶”假說。在細胞有絲分裂過程中，伴隨著部分端粒序列的丟失，端粒長度縮短。當端粒縮短至一定長度時

18、，可能觸發(fā)某種信號，使細胞進入Hayflick限制或第一死亡期（M1期）(mortality stage 1)，此時細胞不再分裂并出現(xiàn)老化。如果細胞被病毒轉(zhuǎn)化，或者某些抑癌基因的突變，細胞越過M1期繼續(xù)分裂，端粒繼續(xù)縮短，最終達到一個關(guān)鍵閾值，細胞進入M2期(mortality stage 2) 。這時，染色體可能出現(xiàn)異常形態(tài)，某些細胞因端粒太短喪失功能而導致細胞死亡，但極少數(shù)細胞在此階段激活了端粒酶，端粒功能得以恢復，染色體穩(wěn)定，從而

19、逃避M2危機，獲得永生化。,1994年發(fā)現(xiàn)端粒酶僅在人卵巢細胞中表達，而在正常卵巢細胞中缺乏，才真正開始意識到端粒、端粒酶在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要性。,五.端粒酶的活性與惡性腫瘤,近年來，人們對人體惡性腫瘤組織端粒酶的活性進行檢測，結(jié)果顯示，絕大多數(shù)惡性腫瘤組織均顯示明顯的端粒酶活性，而在正常細胞株和癌旁組織標本中端粒酶幾乎全部為陰性。這有力佐證了端粒酶的激活在維持細胞永生化、促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面所具有的重要意義。端粒端粒酶與細胞永

20、生和腫瘤的關(guān)系可用M1/M2假說來解釋，即細胞獲得永生化必須克服兩個死亡危機期。端粒酶特異地表達于各種腫瘤細胞，是大多數(shù)腫瘤細胞持續(xù)分裂所必需的，因此，端粒酶活性是診斷多數(shù)惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標。,端粒酶可作為腫瘤早期診斷的指標人們試圖抑制端粒酶活性來治療腫瘤，它可能比目前所使用的化學療法和基因療法具更大的優(yōu)勢。端粒酶抑制劑具有較高的特異性和較少的副作用，并具有廣譜性。傳統(tǒng)療法對早期腫瘤最有效，而端粒酶抑制劑可能對晚期和擴

21、散腫瘤也有效。端粒酶活性的監(jiān)測可作為判斷腫瘤腫瘤大小、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分級及預后的重要指標體外研究發(fā)現(xiàn)端粒酶活性與腫瘤細胞的分化呈負相關(guān),端粒、端粒酶與腫瘤研究中遇到的幾個基本問題：,在端粒酶陽性細胞中，端粒酶是腫瘤細胞形成的原因還是結(jié)果，在端粒酶陰性的腫瘤細胞中，通常具較長的端粒，其端粒又是怎么合成與維持的。在有的永生細胞系中觀察到端粒長度的突然大幅度增長或縮短，而端粒酶的活性卻無變化。這些情況提示了還有不依賴端粒酶