導入端粒酶延長正?？谇徽衬そ腔毎麎勖芯?pdf

1、上海第二醫(yī)科大學博士學位論文導入端粒酶延長正?？谇徽衬そ腔毎麎勖芯啃彰褐芎Ｎ纳暾垖W位級別：博士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學（口腔內(nèi)科學）指導教師：周曾同2003.4.1刷海文上海第二醫(yī)科火學博士學位論文(2003年)中文摘要目的：建立一個穩(wěn)定的人正常口腔粘膜角化細胞體外培養(yǎng)體系；將端粒酶導入人正常口腔粘膜角化細胞延長細胞壽命，為口腔粘膜癌前病變的細胞模型研究奠定基礎。方法：比較傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)、改良組織塊培養(yǎng)、酶消化培養(yǎng)法，從中建立穩(wěn)定的人正

2、?？谇徽衬そ腔毎w外培養(yǎng)體系；通過細胞形態(tài)學、超微結構觀察及角蛋白免疫組化染色等對細胞進行定性研究；通過測定細胞生長曲線及克隆形成率了解細胞生長基本規(guī)律及其增殖能力；經(jīng)流式細胞儀檢測細胞染色體倍性；通過亞克隆方法構建重組pEGFP—hTRT質(zhì)粒載體，經(jīng)電泳及測序鑒定，轉染293細胞后熒光觀察，RT—PCR檢測外源性端粒酶表達了解新構質(zhì)粒能否在真核細胞中表達；采用脂質(zhì)體介導pEGFP—hTRT轉染OKg，優(yōu)化轉染體系，激光共聚焦顯微鏡觀

3、察轉染結果：采用pBABE—tert重組逆轉錄病毒轉染OKC，RT—PCR檢測外源性端粒酶，并檢測端粒酶活性；通過細胞生物學一般性狀：包括細胞形態(tài)、生長速度和倍增時間及染色體倍性、B半乳糖苷酶染色細胞衰老研究、軟瓊脂培養(yǎng)、裸鼠接種致瘤試驗比較轉染前后細胞生物學性狀。結果：采用Dispase酶及胰蛋白酶消化法，用無血清角化細胞培養(yǎng)液，在無3T3細胞的條件下可成功地進行人正?？谇徽衬そ腔毎B續(xù)傳代培養(yǎng)，細胞可傳45代，存活30一50天；培

4、養(yǎng)細胞具有上皮細胞的典型形態(tài)，細胞呈多角形，具有豐富的橋粒及大量張力絲等特征性超微結構，角蛋白染色陽性；細胞接種后第卜3天為靜止生長期，第5—10天處于對數(shù)生長期，第12天后進入平臺期，倍增時間為24—48小時；接種密度為200個細胞／c砰時，培養(yǎng)細胞克隆形成率為0979％；原代及傳代細胞均為二倍體細胞；重組pEGFPhTRT質(zhì)粒載體經(jīng)電泳及測序比對序列正確；轉染293細胞后熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察可見綠色熒光在細胞核中表達；R