靶向VEGF的siRNA表達(dá)框架（SECs）抑制人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株（Hep-2）生長的實驗研究.pdf

1、第一部分VEGF在人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(Hep-2)中的表達(dá)及意義 目的:檢測人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)中是否有VEGF基因的表達(dá)以及表達(dá)的水平，為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。 方法:應(yīng)用RT-PCR方法檢測人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)中VEGF基因的mRNA的表達(dá)；Hep-2細(xì)胞的總RNA使用Trizol提取，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用OligodT，每個反應(yīng)使用等量的RNA(5μ1)，VEGF引物由武漢伯杰生物技術(shù)有限公司合

2、成，上游引物：5'CAGCCCCAGCTACCACCTC3'；下游引物：5'TCTTCCTCCTCCCCCTCCTC3'，VEGFcDNA中的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約268bp。內(nèi)參照選擇β-actin，上游引物：5'GCACTCTTCCAGCCTTCCTTC3'，下游引物：5'CTGTCACCTTCACCGTTCCA3'，Tm62度，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約508bp。電泳檢測PCR產(chǎn)物，在紫外燈下觀察結(jié)果，與Marker(DL2000)對比分子量，采用

3、quantiscan軟件對電泳圖像掃描分析并計算VEGF與β-actin吸光度(A)。 結(jié)果:應(yīng)用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)中VEGF基因有很強(qiáng)的表達(dá)，表明VEGF在人喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用。 結(jié)論: 1.RT-PCR方法檢測提示人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)中VEGF的mRNA有很強(qiáng)的表達(dá)。 2.VEGF基因可能在人喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、生長

4、和轉(zhuǎn)移過程中起到至關(guān)重要的作用。 第二部分使用siRNA表達(dá)框架的方法對靶向VEGF特異性設(shè)計的siRNA序列進(jìn)行篩選 目的：設(shè)計合成特異性干擾人VEGF基因的siRNA序列。 方法：在Genebank人K-ras基因組全序列中，篩選符合合成siRNA序列要求的序列，用BLAST工具排除同源序列；從這些序列中篩選符合siRNA表達(dá)框架法設(shè)計要求的序列作為其PCR擴(kuò)增的特異性下游引物。 結(jié)果：按照以上要求

5、我們挑選了四個siRNA序列，這四個序列分別位于第1130位點、1498位點、1366位點和1492位點。1130位點的正義引物序列為5'AAGGAGGAGGGCAGAATCATC3'1130位點的反義引物序列為5'AAGATGATTCTGCCCTCCTCC3'1498位點正義引物序列為5'AAGCGCAAGAAATCCCGGTAT3'1498位點的反義引物序列為5'AAATACCGGGATTTCTTGCGC3'1366位點正義引物序列

6、為5'AAACCTCACCAAGGCCAGCAC3'1366位點的反義引物序列為5'AAGTGCTGGCCTTGGTGAGGT3'1492位點正義引物序列為5'AAACGAAAGCGCAAGAAATCC3'1492位點的反義引物序列為5'AAGGATTTCTTGCGCTTTCGT3'陰性對照正義引物序列為5'AAACGAACAGGCAAGAAATCC3'陰性對照反義引物序列為5'AAGGATTTCTTGCCTGTTCGT3' 結(jié)

7、論：我們在人VEGF基因組全序列中找到了符合siRNA表達(dá)框架法設(shè)計要求的四個siRNA序列并設(shè)計了陰性對照。 第三部分使用siRNA表達(dá)框架的方法進(jìn)行擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)中的轉(zhuǎn)染 目的：應(yīng)用siRNA表達(dá)框架法擴(kuò)增PCR產(chǎn)物并將擴(kuò)增的產(chǎn)物轉(zhuǎn)染入人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)。 方法：以實驗第二部分篩選的siRNA序列作為下游引物，用PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物構(gòu)建不同位點的siR

8、NA表達(dá)框架，產(chǎn)物純化后利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入Hep-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。 結(jié)果： 1.PCR擴(kuò)增出正確的DNA產(chǎn)物；2.轉(zhuǎn)染后48小時后倒置顯微鏡下觀察可見1366位點干擾的細(xì)胞組生長速度明顯減慢，細(xì)胞可見皺縮、變圓并開始脫落；而其他三個位點的細(xì)胞形態(tài)學(xué)上未見明顯的改變，生長速度和形態(tài)與正常細(xì)胞的生長狀態(tài)相比沒有明顯的區(qū)別；陰性對照細(xì)胞和空轉(zhuǎn)細(xì)胞的生長速度都正常，形態(tài)完整、飽滿，未表現(xiàn)出凋

9、亡形態(tài)。 結(jié)論： 1.siRNA表達(dá)框架中PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物純化后在電泳圖上位于正確的位置； 2.帶有1366位點siRNA序列的DNA片斷轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，細(xì)胞生長和形態(tài)發(fā)生特異性變化；而帶有其他位點siRNA序列的DNA片斷轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，細(xì)胞生長和形態(tài)無明顯改變。 第四部分轉(zhuǎn)染后的人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)VEGF表達(dá)的檢測及其凋亡的檢測 目的：從功能和蛋白水平來檢測和評價靶向VEG

10、F基因的siRNA表達(dá)框架轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株(Hep-2)后對其生長的影響以及VEGF基因被封閉的情況；探討RNA干擾技術(shù)抑制人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長的效果以及作為腫瘤基因治療工具的應(yīng)用前景。 方法：應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2在siRNA干擾下凋亡細(xì)胞的變化，應(yīng)用RT-PCR、免疫熒光、Westernblot法分別檢測VEGF基因在被siRNA干擾下mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變。 結(jié)果：對照組細(xì)胞生

11、長正常，轉(zhuǎn)染1366位點的siRNA片段實驗組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，VEGF基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組明顯減弱；而轉(zhuǎn)染入其它三個位點siRNA片段的細(xì)胞凋亡數(shù)與對照組無明顯差別，檢測VEGF基因的mRNA和蛋白水平較對照組無明顯差別。 結(jié)論：針對VEGF基因標(biāo)準(zhǔn)序列設(shè)計的四段siRNA表達(dá)框架中，1366位點的siRNA片段能強(qiáng)有效地抑制VEGF基因的復(fù)制和表達(dá)，幾乎能達(dá)到“基因敲除”的效果，從而抑制人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞