RhoC對喉鱗狀細胞癌Hep2細胞的影響.pdf

1、目的:
　　通過外源基因導入技術抑制和增強喉鱗狀細胞癌細胞-Hep2中RhoC(Ras homology C,Ras同源類似物C)表達,觀察腫瘤細胞凋亡、運動、形態(tài)學變化及腫瘤干細胞標記物ALDH1A1(Aldehyde dehydrogenase1 family, member A1乙醛脫氫酶1A1)表達的變化,研究RhoC對喉鱗狀細胞癌生物學行為及腫瘤起始細胞群-腫瘤干細胞的影響,為以RhoC為治療靶點控制喉鱗癌的轉移提供實驗

2、支持。
　　方法:
　　(1)通過分子生物學方法設計合成干擾RhoC表達可轉錄形成RhoC-shRNA(RhoC-short hairpin ribonucleic acid,RhoC短發(fā)卡核糖核酸)從而抑制 RhoC表達的 RhoC-shRNA基因重組質粒GW-shRNA( RhoC-shRNA基因真核表達質粒載體為pENTR?/U6-EGFP)和增強RhoC表達的RhoC G14V基因重組質粒13GS03( RhoC G

3、14V基因真核表達質粒載體為pcDNA3.1-EGFP)。(2)運用脂質體轉染方法,將重組質粒轉染至喉鱗狀細胞癌細胞系-Hep2細胞中,并通過轉染條件優(yōu)化,獲得最佳細胞轉染率。(3) QPCR(Real-time Quantitative polymerasechainreaction Detecting System,實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng))技術檢測影響 RhoC表達后 Hep2腫瘤干細胞標志物-ALDH1A1的mRNA(mes

4、senger ribonucleic acid,信使RNA)表達。(4)TUNEL法檢測影響RhoC表達后Hep2細胞凋亡情況的變化。(5)熒光染色細胞骨架觀察影響RhoC表達后,Hep2細胞的形態(tài)變化。(6)劃痕實驗觀察影響RhoC表達后Hep2細胞的的運動能力的變化。
　　結果:
　　(1)通過將兩種重組質粒進行基因測序及采用脂質體法轉染293T腎上皮細胞系,證實干擾RhoC表達的重組質粒-GW-shRNA和增強RhoC

5、表達的重組質粒-13GS03構建成功。
　　(2)24孔板培養(yǎng)條件下,抑制 RhoC表達的重組質粒GW-shRNA和增強RhoC表達的重組質粒13GS03與脂質體以1.2μg質粒與4.2μl脂質體混合形成的轉染復合物,Hep2喉鱗癌細胞轉染率最高。
　　(3)抑制Hep2細胞RhoC表達后:腫瘤干細胞標記物ALDH1A1表達顯著降低;凋亡增強;細胞形態(tài)改變明顯,胞體較大,形狀近似多邊形。
　　(4)增強Hep2細胞Rh

6、oC表達后:腫瘤干細胞標記物 ALDH1A1及腫瘤細胞凋亡較未處理Hep2細胞變化不顯著;細胞形態(tài)變化明顯,細胞近似梭形,類似間充質細胞形態(tài),提示細胞運動能力增強。
　　(5)劃痕實驗檢測細胞運動能力結果顯示抑制RhoC表達使喉鱗癌Hep2腫瘤細胞運動能力減低;增強RhoC表達后Hep2腫瘤細胞運動能力增強。
　　結論:
　　1、成功構建抑制RhoC表達重組質粒GW-shRNA和增強RhoC表達重組質粒13GS03,為

7、后續(xù)研究RhoC在喉鱗癌Hep2細胞中的功能奠定了實驗基礎。
　　2、通過QPCR技術檢測增強RhoC表達后喉鱗狀細胞癌Hep2腫瘤細胞群中腫瘤干細胞標記物ALDH1A1與空白對照組相比無顯著變化,但抑制RhoC表達后ALDH1A1顯著降低,間接說明了RhoC參與喉鱗癌腫瘤干細胞的形成,在轉移灶起始發(fā)生中具有一定的作用。
　　3、通過改變Hep2細胞中RhoC表達,觀察腫瘤細胞的凋亡情況,結果顯示增強RhoC表達后細胞腫瘤細

8、胞凋亡現(xiàn)象不明顯,與對照組相比無明顯變化,抑制RhoC表達腫瘤細胞凋亡增強,說明RhoC具有抑制喉鱗癌腫瘤細胞凋亡的作用,提高了腫瘤細胞在轉移擴散中對周圍陌生環(huán)境的適應能力,使具有活性的腫瘤細胞能夠順利到達轉移瘤發(fā)生部位。
　　4、通過改變RhoC表達觀察Hep2細胞形態(tài)及運動能力的變化,結果顯示,增強RhoC表達后喉鱗癌腫瘤細胞運動能力增強,抑制RhoC表達后腫瘤細胞運動能力減弱,說明RhoC對喉鱗癌腫瘤細胞擴散轉移具有促進作用