柑橘衰退病RNAi載體構建、遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的評價.pdf

1、柑橘產(chǎn)業(yè)是我國南方農(nóng)村的重要支柱產(chǎn)業(yè)，而每年由柑橘衰退病病毒(Citrus tristezavirus，CTV)造成的經(jīng)濟損失巨大。柑橘衰退病病毒屬于正義單鏈RNA病毒。由于利用RNAi技術進行抗植物RNA病毒已有大量成功的報道，所以應用RNAi原理進行抗CTV育種可能成為解決CTV防治的有效方法。
　　 RNA病毒侵染植物時，一般表達沉默抑制因子使宿主植物細胞中RNAi機制鈍化從而達到成功侵染植物的目的。因此阻斷病毒的沉默抑制

2、因子的表達將有助于植物抵抗病毒的侵染，從而達到抗病毒的效果。本試驗將CTV中三個沉默抑制因子p25、p20和p23作為RNAi靶標序列，目的是要獲得對柑橘CTV有廣譜抗性的柑橘品種。
　　 (1)RNAi載體的構建、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的驗證
　　 根據(jù)CTV基因組RNA中的沉默抑制因子p25、p20和p23的序列保守區(qū)域設計引物，經(jīng)RT-PCR成功克隆相關基因片段。利用重疊延伸PCR拼接法(Gene Splicing by

3、Overlap Extension，SOE)拼接PCR產(chǎn)物，獲得兩條多基因大片段P2520、P252023。
　　 為了便于克隆操作，在正向片段下游引物末端加上限制性內(nèi)切酶BglⅡ識別序列；在巢式PCR上游引物末端加上KpnⅠ識別序列，下游引物加上BglⅡ識別序列，經(jīng)TA克隆得到含兩個沉默抑制因子p25和p20基因片段的反向重復序列載體pTZ57R-HP2520。應用同樣的方法得到含三個沉默抑制因子p25、p20和p23基因片段

4、的反向重復序列載體pTZ57R-HP252023。
　　 載體pTZ57R-HP2520與pCAMBIA-2301G經(jīng)SacⅠ和BamHI雙酶切，膠回收目的片段后用T4-DNA連接酶連接兩個片段，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒后用SacⅠ和BamHI雙酶切檢測目的片段。然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404菌株。
　　 含有質(zhì)粒pCAMBIA2301-HP2520的農(nóng)桿菌被用來與錦橙上胚軸共培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。本試

5、驗共獲得了抗性不定芽20個，嫁接后再生成活7株，利用T-DNA區(qū)域內(nèi)的GUS基因特異引物PCR檢測6株為陽性，同時用NPTⅡ基因特異引物PCR檢測7株為陽性。
　　 應用同樣的方法獲得RNAi雙元質(zhì)粒表達載體pCAMBIA2301-HP252023，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化錦橙上胚軸后誘導獲得抗性不定芽1個，嫁接再生成活1株，經(jīng)特異引物檢測發(fā)現(xiàn)GUS基因和NPTⅡ基因均為陽性。
　　 (2)pCAMBIA2301-HP20轉(zhuǎn)基因酸

6、橙植株的評價
　　 分兩步對本實驗室已經(jīng)構建好的針對沉默抑制因子p20的單基因片段RNAi(pCAMBIA2301-HP20)轉(zhuǎn)基因酸橙植株進行評價。首先，8株轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過GUS組織化學染色鑒定和針對p20基因的特異引物PCR檢測，證實所有的轉(zhuǎn)基因植株都成功的轉(zhuǎn)入了目的片段。其次，將轉(zhuǎn)基因植株嫁接備份后做攻毒試驗，即對其中5株轉(zhuǎn)基因植株嫁接接種CTV強毒系TRL514。分別在接毒30d、50d和60d后用RT-PCR檢測CTV