產(chǎn)乙醇桿菌屬功能基因克隆表達(dá)及基因敲除載體構(gòu)建.pdf

1、有機(jī)廢水發(fā)酵法生物制氫技術(shù)具有能源和環(huán)保的雙重功效，已經(jīng)成為環(huán)境生物技術(shù)和新能源領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。但是該技術(shù)目前還處于研發(fā)階段，如何提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的產(chǎn)氫能力已成為實(shí)現(xiàn)該技術(shù)工業(yè)化進(jìn)程中所面臨的關(guān)鍵性問(wèn)題。針對(duì)這一關(guān)鍵性問(wèn)題，依據(jù)現(xiàn)有的生物產(chǎn)氫代謝理論和代謝工程調(diào)控理論，通過(guò)對(duì)現(xiàn)有高效產(chǎn)氫菌進(jìn)行代謝工程改造，構(gòu)建更高效的產(chǎn)氫基因工程菌，成為實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化非常有潛力的策略之一。本論文以乙醇發(fā)酵高效產(chǎn)氫菌Ethanoligenensha

2、rbinenseB49為出發(fā)菌株，克隆、表達(dá)與產(chǎn)氫相關(guān)的、控制末端代謝產(chǎn)物生成的關(guān)鍵酶基因，如對(duì)丙酮酸產(chǎn)氫途徑和NADH產(chǎn)氫途徑有影響的L-乳酸脫氫酶基因，對(duì)NADH產(chǎn)氫途徑有影響的乙醛乙醇脫氫酶基因和乙醇脫氫酶基因，對(duì)反應(yīng)中酸堿度有影響的乙酸激酶基因。并分別構(gòu)建了用于基因敲除目的的置換型基因敲除載體。本項(xiàng)研究克隆了涉及乙醇發(fā)酵和產(chǎn)氫發(fā)酵的重要基因，并構(gòu)建了相應(yīng)的基因敲除載體，這些資源的獲得將在揭示乙醇發(fā)酵機(jī)理、乙醇發(fā)酵產(chǎn)氫機(jī)理、等方面

3、有重要意義，也是系統(tǒng)、多方位地研究發(fā)酵法生物制氫菌種代謝工程研究的開(kāi)始。
　　利用簡(jiǎn)并引物PCR和cassettePCR技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了控制丙酮酸生成乳酸的L-乳酸脫氫酶基因（L-ldh）的完整DNA序列。L-ldh片段DNA長(zhǎng)2490bp，其在GenBank上的注冊(cè)號(hào)為DQ179104。編碼區(qū)DNA長(zhǎng)951bp，編碼316aa，編碼蛋白的分子量為34.23kD，理論等電點(diǎn)為6.09。SignalP預(yù)測(cè)表明L-ldh氨基酸序

4、列的N端21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，說(shuō)明L-ldh可能為分泌型酶。同時(shí)，將克隆得到的L-ldh基因在E.coli中異源表達(dá)。以獲得的序列為基礎(chǔ)，采用pET-22b和pJIR751質(zhì)粒構(gòu)建了以卡那霉素抗性基因?yàn)閳?bào)告基因的L-ldh置換型基因敲除載體，其中長(zhǎng)臂長(zhǎng)1400bp，短臂長(zhǎng)650bp。
　　利用簡(jiǎn)并引物PCR和CassettePCR技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了控制乙酰輔酶A生成乙酸的乙酸激酶基因（ack）的完整DNA序列。Ack片段DNA

5、長(zhǎng)2980bp，其在GenBank上的注冊(cè)號(hào)為DQ179102。編碼區(qū)DNA長(zhǎng)1200bp，編碼399aa，編碼蛋白的分子量為43.22kD，理論等電點(diǎn)為5.93。同時(shí)，將克隆得到的ack基因在E.coli中異源表達(dá)。以獲得的序列為基礎(chǔ)，采用pET-22b構(gòu)建了以氯霉素抗性基因?yàn)閳?bào)告基因的乙酸激酶基因置換型基因敲除載體，其中長(zhǎng)臂長(zhǎng)1700bp，短臂長(zhǎng)690bp。
　　利用簡(jiǎn)并引物PCR和cassettePCR技術(shù)相結(jié)合的方法克隆了

6、控制乙醇生成的乙醇脫氫酶（adh）、乙醛乙醇脫氫酶（adhE）和氧化還原轉(zhuǎn)錄抑制因子Rex（Rex）基因。AdhE和Rex基因DNA片段長(zhǎng)3747bp長(zhǎng)，其在GenBank上的注冊(cè)號(hào)為DQ179103。Adh基因DNA片段長(zhǎng)1902bp，其在GenBank上的注冊(cè)號(hào)為EU196512。AdhE編碼區(qū)DNA長(zhǎng)2616bp，編碼871aa，編碼蛋白的分子量為95.47kD，理論等電點(diǎn)為6.16。Rex編碼區(qū)DNA長(zhǎng)657bp，編碼218aa