產(chǎn)乙醇桿菌屬突變菌株YR-3的產(chǎn)氫行為及其突變機(jī)制.pdf

1、人類的生存和發(fā)展都離不開能源，能源的短缺已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)際社會(huì)急需解決的難題之一；氫能作為一種清潔、高效、安全、可持續(xù)的新能源，被視為21世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿Φ哪茉矗阎饾u成為能源界關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　發(fā)酵法生物制氫技術(shù)在工藝改進(jìn)、運(yùn)行調(diào)控、擴(kuò)大原料利用范圍及高效菌株篩選等方面都取得相當(dāng)大的進(jìn)展。決定發(fā)酵法生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵指標(biāo)是提高系統(tǒng)的產(chǎn)氫能力和降低生產(chǎn)成本。在菌種產(chǎn)氫能力方面，各國(guó)學(xué)者致力于從自然界或產(chǎn)氫反應(yīng)器中分離篩選更高產(chǎn)

2、氫的野生菌株，同時(shí)也利用傳統(tǒng)的誘變手段及基因工程手段改良產(chǎn)氫菌種，以縮短獲得高產(chǎn)氫菌株的歷程。
　　針對(duì)提高野生菌株的產(chǎn)氫能力，本文改進(jìn)傳統(tǒng)的育種手段對(duì)野生產(chǎn)氫菌EthanoligenensharbinenseZGX4進(jìn)行誘變育種，經(jīng)穩(wěn)定性考察后得到一株產(chǎn)氫能力可提高40％左右的產(chǎn)氫突變株YR-3，并對(duì)其發(fā)酵行為進(jìn)行了深入探討。利用AFLP技術(shù)及雙相蛋白電泳（2-DE）技術(shù)分別對(duì)其進(jìn)行酶切后的基因多態(tài)性和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，初步分析了

3、高產(chǎn)突變菌株的產(chǎn)氫代謝突變機(jī)制。
　　通過對(duì)比不同誘變因子對(duì)產(chǎn)氫細(xì)菌ZGX4的誘變效應(yīng)，確定紫外線+亞硝酸復(fù)合誘變方式對(duì)產(chǎn)氫細(xì)菌ZGX4的誘變效果最佳。利用這種處理方式篩選到產(chǎn)氫能力提高較大而且有較好絮凝能力的突變菌株。對(duì)分離培養(yǎng)基LM-1進(jìn)行了簡(jiǎn)化，結(jié)合直接涂布分離培養(yǎng)法，采用紫外線和亞硝酸復(fù)合誘變篩選獲得一株高效產(chǎn)氫突變菌株YR-3，生理生化指標(biāo)和形態(tài)特征分析結(jié)果表明，YR-3的表型上已經(jīng)發(fā)生了明顯變化。
　　采用間歇培

4、養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分別對(duì)YR-3的培養(yǎng)條件進(jìn)行單因子探討，并進(jìn)一步利用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法（RSM）對(duì)影響YR-3發(fā)酵產(chǎn)氫能力的四種因素（mC/mN、PBS濃度、初始pH、生物素）進(jìn)行了分析，確定YR-3發(fā)酵產(chǎn)氫的最適培養(yǎng)條件：溫度37±1℃，初始pH6.0，磷酸鹽緩沖液80mM，mC/mN5.5，生物素1.4mg/L。
　　間歇培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)比野生菌株ZGX4菌株和突變菌株YR-3的產(chǎn)氫性能，結(jié)果表明，突變株YR-3仍然為典型的乙醇厭氧發(fā)酵細(xì)

5、菌，液相代謝產(chǎn)物中的乙醇和乙酸摩爾濃度比值在1.7～2.2，比野生菌株ZGX4的乙醇和乙酸摩爾濃度比值高24.1～37.5%，而且顯示很強(qiáng)的產(chǎn)氫代謝能力，最大比產(chǎn)氫速率為2.85molH2/mol葡萄糖，是對(duì)照菌株ZGX4（2.04molH2/mol葡萄糖）的1.40倍；最大單位細(xì)胞產(chǎn)氫速率為37.5mmol/gCDW·h，是對(duì)照菌株ZGX4的1.48倍。
　　利用連續(xù)流方式培養(yǎng)突變菌株YR-3，證實(shí)了突變菌株顯現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)氫能力

6、。以葡萄糖為底物，72h內(nèi)YR-3的累積產(chǎn)氫量為29.7LH2/L-培養(yǎng)液，是對(duì)照Z(yǔ)GX4（20.1LH2/L-培養(yǎng)液）的1.5倍。YR-3的最大比產(chǎn)氫速率為2.52molH2/mol葡萄糖，比野生菌株ZGX4（1.79molH2/mol葡萄糖）提高約40%左右；以糖蜜為底物，72h內(nèi)YR-3的累積產(chǎn)氫量為16.2LH2/L-培養(yǎng)液，是對(duì)照Z(yǔ)GX4（9.76LH2/L-培養(yǎng)液）的1.7倍。YR-3的平均產(chǎn)氫速率最大為13.1mmolH2

7、/g·CDW·h，是對(duì)照Z(yǔ)GX4（8.3mmolH2/g·CDW·h）的1.6倍。
　　借助AFLP技術(shù)和2-DE研究手段對(duì)突變菌株YR-3的突變機(jī)制進(jìn)行了探討，證實(shí)產(chǎn)氫突變菌株YR-3遺傳基因組發(fā)生了部分變異。確定突變株YR-3的乳酸脫氫酶基因和乙醇脫氫酶（ADH）基因發(fā)生了變化，可能是引起YR-3代謝產(chǎn)物中乙醇和乙酸摩爾比值提高的原因。結(jié)合2-DE技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分析和比較YR-3和ZGX4蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，突變體YR-3在總蛋白的