哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌模式菌株YUAN-3 Sau3AⅠ與PstⅠ酶切基因組文庫的構(gòu)建.pdf

1、哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3(Ethanoligens harbinense)是本實(shí)驗(yàn)室從生物制氫反應(yīng)器中分離得到的一株具有自凝集能力的高效產(chǎn)氫菌種，它的發(fā)酵過程不同于傳統(tǒng)的丁酸型發(fā)酵體系，因而其產(chǎn)氫過程中很多機(jī)理亟需探討。本課題的研究目的就是構(gòu)建哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌YUAN-3菌株的Sau3AI和PstI兩個(gè)酶切基因組文庫，應(yīng)用兩種酶切的基因組文庫，構(gòu)建基因篩選的平臺(tái)，用于分離YUAN-3菌株的全長基因，以尋找各種目的基因，并為后期展開功

2、能基因的研究打下良好的基礎(chǔ)。
　　分別采用四堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制酶Sau3AI和六堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制酶PstI作為工具酶，最大可能地含蓋菌株基因組所有完整的目的基因片段，以pUC19質(zhì)粒作為載體，經(jīng)完全酶切和堿性磷酸酶處理后，分別與部分酶切的YUAN-3菌株基因組DNA1000bp-3000bp的DNA片段連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp的LB平板上篩選重組子，隨機(jī)挑取陽性克隆子，經(jīng)DNA測序，在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)

3、行BLAST分析，得到一系列相似基因、蛋白的比對結(jié)果。這些結(jié)果為YUAN-3菌株的研究，提供了一條從分子水平上探討的技術(shù)路線。
　　文庫的構(gòu)建過程中，詳細(xì)討論了基因組部分酶切、載體完全酶切、去磷酸化等各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件。菌株高濃度基因組樣品的制備、重組體構(gòu)建過程中DNA片段的最佳連接比例及宿主菌株對重組體所具有的高感受能力為基因組文庫的完整性構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。文庫構(gòu)建完成后，分別從文庫的代表性、重組DNA片段的序列完整性和多樣性、文