一個(gè)衣藻突變株產(chǎn)氫特性的初步研究.pdf

1、世界性的能源危機(jī)和環(huán)境污染使開(kāi)發(fā)可再生清潔能源成為當(dāng)務(wù)之急，其中萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，遺傳背景清晰，培養(yǎng)成本低，生長(zhǎng)速度快，氫化酶活性高，能夠利用太陽(yáng)能產(chǎn)生氫氣而被認(rèn)為是非常有開(kāi)發(fā)潛力的生物制氫模式物種。
　　 目前利用衣藻制氫的最大瓶頸是氫化酶對(duì)氧氣特別敏感，使得衣藻氫氣產(chǎn)量低，達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，所以如何提高衣藻產(chǎn)氫效率是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，目前國(guó)際上從以下三條途徑來(lái)研究

2、衣藻產(chǎn)氫代謝機(jī)理和提高氫氣產(chǎn)量：①篩選耐氧的高產(chǎn)氫突變株或改造氫化酶結(jié)構(gòu)使其耐氧②降低細(xì)胞內(nèi)的氧濃度③提高電子傳遞效率。
　　 因?yàn)橐略瀹a(chǎn)氫的代謝機(jī)理比較復(fù)雜，目前還沒(méi)有完全研究清楚，篩選衣藻產(chǎn)氫突變株并進(jìn)行產(chǎn)氫代謝機(jī)理的研究還十分必要。本實(shí)驗(yàn)室利用對(duì)衣藻細(xì)胞核基因隨即突變的方法得到一個(gè)產(chǎn)氫量提高約7倍的突變株，為深入研究衣藻產(chǎn)氫代謝機(jī)理提供了一個(gè)很好的實(shí)驗(yàn)材料。本研究通過(guò)分子生物學(xué)和生理實(shí)驗(yàn)對(duì)該突變株產(chǎn)氫有關(guān)的代謝特征進(jìn)行了初

3、步研究，為深入揭示萊茵衣藻產(chǎn)氫代謝機(jī)理和利用基因工程手段進(jìn)一步提高衣藻產(chǎn)氫量提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ①對(duì)細(xì)胞核基因隨機(jī)突變獲得突變株：利用玻璃珠轉(zhuǎn)化法將含有腐草霉素(Zeocin)抗性的ble基因的質(zhì)粒pSP124S DNA隨機(jī)插入萊茵衣藻藻種cc849的細(xì)胞核基因組中，得到105個(gè)具有腐草霉素抗性的突變株藻單克隆。
　　 ②通過(guò)抗生素和氣相色譜檢測(cè)篩選產(chǎn)氫突變株：從具

4、有腐草霉素抗性的轉(zhuǎn)化子中篩選到一株產(chǎn)氫量較高的突變株(暫命名為T(mén)1)，在600ml體系培養(yǎng)、光照為100μmol·m-2·s-1、完全缺硫條件下，突變株T1的產(chǎn)氫量為3386.4μl·mg-1Chl，而對(duì)照組衣藻cc849的產(chǎn)氫量為433.6μl·mg-1Chl，突變株T1的產(chǎn)氫量提高了6.8倍，同時(shí)突變株T1產(chǎn)氫培養(yǎng)體系中氧氣含量較低，為0.2％，而對(duì)照組衣藻cc849的為1.4％。
　　 ③通過(guò)PCR和RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)突變

5、株T1進(jìn)行了DNA和RNA水平的檢測(cè)，初步證明外源ble基因成功整合到衣藻細(xì)胞核基因組DNA中，并得到正確轉(zhuǎn)錄。
　　 ④通過(guò)對(duì)突變株T1生長(zhǎng)情況的檢測(cè)表明：在弱光(30μmol·m-2·s-1)和強(qiáng)光(100μmol·m-2·s-1)下突變株T1的生長(zhǎng)都未受到抑制。
　　 ⑤通過(guò)對(duì)突變株T1的光合放氧活性和呼吸強(qiáng)度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：無(wú)論在弱光下還是在強(qiáng)光下，突變株T1的光合強(qiáng)度都比對(duì)照組衣藻cc849弱，其最大真實(shí)光合速率為1

6、8.8μmol/mgchl·h，而對(duì)照組衣藻cc849則為31.01μmol/mgchl·h；突變株T1的呼吸速率比對(duì)照組衣藻cc849強(qiáng)，為7.01μmol/mgchl·h，cc849的為5.72μmol/mgchl·h，因而突變株T1的P/R值比對(duì)照藻849低。
　　 ⑥通過(guò)檢測(cè)突變株T1的PSⅡ活性發(fā)現(xiàn)：突變株T1的PSⅡ活性都比對(duì)照藻849低，突變株T1的Fv/Fm值為0.4-0.5，對(duì)照組衣藻cc849的Fv/Fm為0

7、.55-0.65；突變株T1的Fv/F0為0.7-1.06，對(duì)照組衣藻cc849的Fv/F0為1.45-1.75。
　　 ⑦檢測(cè)硫元素對(duì)突變株T1產(chǎn)氫的影響，結(jié)果表明：無(wú)論培養(yǎng)基中硫元素含量為多少，突變株T1的氫氣產(chǎn)量都比對(duì)照組衣藻cc849的高。且在培養(yǎng)基中完全缺硫的條件下，突變株T1和對(duì)照組衣藻cc849的產(chǎn)氫量都達(dá)到最高、氧氣含量最低，分別為4557μl·mg-1Chl、208μl·mg-1Chl和0％和1.4％(細(xì)胞濃度

8、為1.5mg·bottle-1葉綠素)。
　　 ⑧通過(guò)優(yōu)化產(chǎn)氫培養(yǎng)的光照強(qiáng)度和細(xì)胞濃度，結(jié)果表明：突變株T1在50ml培養(yǎng)體系中、葉綠素含量為0.5mg·bottle-1、光照強(qiáng)度為30μmol·m-2·s-1時(shí)、完全缺硫條件下，氫氣產(chǎn)量最高，為7197μl·mg-1Chl，氧氣含量占瓶中氣體的0.9％。
　　 ⑨外源碳源和氮源對(duì)衣藻產(chǎn)氫的影響：在正常培養(yǎng)基中添加葡萄糖促進(jìn)了產(chǎn)氫，當(dāng)添加量為6g·L-1時(shí)氫氣產(chǎn)量達(dá)到最高