一個衣藻突變株產氫特性的初步研究.pdf

1、世界性的能源危機和環(huán)境污染使開發(fā)可再生清潔能源成為當務之急，其中萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因其結構簡單，遺傳背景清晰，培養(yǎng)成本低，生長速度快，氫化酶活性高，能夠利用太陽能產生氫氣而被認為是非常有開發(fā)潛力的生物制氫模式物種。
　　 目前利用衣藻制氫的最大瓶頸是氫化酶對氧氣特別敏感，使得衣藻氫氣產量低，達不到工業(yè)化生產的要求，所以如何提高衣藻產氫效率是當前的研究熱點，目前國際上從以下三條途徑來研究

2、衣藻產氫代謝機理和提高氫氣產量：①篩選耐氧的高產氫突變株或改造氫化酶結構使其耐氧②降低細胞內的氧濃度③提高電子傳遞效率。
　　 因為衣藻產氫的代謝機理比較復雜，目前還沒有完全研究清楚，篩選衣藻產氫突變株并進行產氫代謝機理的研究還十分必要。本實驗室利用對衣藻細胞核基因隨即突變的方法得到一個產氫量提高約7倍的突變株，為深入研究衣藻產氫代謝機理提供了一個很好的實驗材料。本研究通過分子生物學和生理實驗對該突變株產氫有關的代謝特征進行了初

3、步研究，為深入揭示萊茵衣藻產氫代謝機理和利用基因工程手段進一步提高衣藻產氫量提供理論依據(jù)和實驗基礎。
　　 本論文的主要內容及結果如下：
　　 ①對細胞核基因隨機突變獲得突變株：利用玻璃珠轉化法將含有腐草霉素(Zeocin)抗性的ble基因的質粒pSP124S DNA隨機插入萊茵衣藻藻種cc849的細胞核基因組中，得到105個具有腐草霉素抗性的突變株藻單克隆。
　　 ②通過抗生素和氣相色譜檢測篩選產氫突變株：從具

4、有腐草霉素抗性的轉化子中篩選到一株產氫量較高的突變株(暫命名為T1)，在600ml體系培養(yǎng)、光照為100μmol·m-2·s-1、完全缺硫條件下，突變株T1的產氫量為3386.4μl·mg-1Chl，而對照組衣藻cc849的產氫量為433.6μl·mg-1Chl，突變株T1的產氫量提高了6.8倍，同時突變株T1產氫培養(yǎng)體系中氧氣含量較低，為0.2％，而對照組衣藻cc849的為1.4％。
　　 ③通過PCR和RT-PCR實驗對突變

5、株T1進行了DNA和RNA水平的檢測，初步證明外源ble基因成功整合到衣藻細胞核基因組DNA中，并得到正確轉錄。
　　 ④通過對突變株T1生長情況的檢測表明：在弱光(30μmol·m-2·s-1)和強光(100μmol·m-2·s-1)下突變株T1的生長都未受到抑制。
　　 ⑤通過對突變株T1的光合放氧活性和呼吸強度檢測發(fā)現(xiàn)：無論在弱光下還是在強光下，突變株T1的光合強度都比對照組衣藻cc849弱，其最大真實光合速率為1

6、8.8μmol/mgchl·h，而對照組衣藻cc849則為31.01μmol/mgchl·h；突變株T1的呼吸速率比對照組衣藻cc849強，為7.01μmol/mgchl·h，cc849的為5.72μmol/mgchl·h，因而突變株T1的P/R值比對照藻849低。
　　 ⑥通過檢測突變株T1的PSⅡ活性發(fā)現(xiàn)：突變株T1的PSⅡ活性都比對照藻849低，突變株T1的Fv/Fm值為0.4-0.5，對照組衣藻cc849的Fv/Fm為0

7、.55-0.65；突變株T1的Fv/F0為0.7-1.06，對照組衣藻cc849的Fv/F0為1.45-1.75。
　　 ⑦檢測硫元素對突變株T1產氫的影響，結果表明：無論培養(yǎng)基中硫元素含量為多少，突變株T1的氫氣產量都比對照組衣藻cc849的高。且在培養(yǎng)基中完全缺硫的條件下，突變株T1和對照組衣藻cc849的產氫量都達到最高、氧氣含量最低，分別為4557μl·mg-1Chl、208μl·mg-1Chl和0％和1.4％(細胞濃度

8、為1.5mg·bottle-1葉綠素)。
　　 ⑧通過優(yōu)化產氫培養(yǎng)的光照強度和細胞濃度，結果表明：突變株T1在50ml培養(yǎng)體系中、葉綠素含量為0.5mg·bottle-1、光照強度為30μmol·m-2·s-1時、完全缺硫條件下，氫氣產量最高，為7197μl·mg-1Chl，氧氣含量占瓶中氣體的0.9％。
　　 ⑨外源碳源和氮源對衣藻產氫的影響：在正常培養(yǎng)基中添加葡萄糖促進了產氫，當添加量為6g·L-1時氫氣產量達到最高