萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）Nfr-4突變株的突變性質(zhì)分析.pdf

1、為了檢測萊茵衣藻突變株Nfr-4的突變性質(zhì)，本文以萊茵衣藻野生型CC-137為對照，通過達(dá)草滅抗性對比分析實(shí)驗(yàn)、反相．高效液相色譜分析突變株Nfr-4和野生型CC-137中的八氫番茄紅素積累情況以及各種類胡蘿卜素和葉綠素含量的變化情況、總?cè)~綠素和總有色類胡蘿卜素含量的檢測、兩種品系生長曲線的對比分析、Pds基因啟動子序列的克隆及測序以及兩品系PDS的mRNA含量的熒光定量PCR分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 達(dá)草滅抗性實(shí)驗(yàn)證明萊茵衣藻突變

2、株Nfr-4具有較強(qiáng)的達(dá)草滅抗性，在混合營養(yǎng)條件下野生型CC-137的達(dá)草滅抗性為2.5μM，而抗性突變株Nfr-4能在5.0μM的達(dá)草滅濃度中存活并生長；在異養(yǎng)條件下野生型CC-137的達(dá)草滅抗性為3.0μM，抗性突變株Nfr-4能在6.5μM濃度的達(dá)草滅中存活并生長。 通過反相-高效液相色譜分析，檢測得到的結(jié)果表明萊茵衣藻野生型CC-137的八氫番茄紅素脫氫酶的底物八氫番茄紅素的含量水平明顯高于突變株Nfr-4中的含量，而各

3、種類胡蘿卜素和葉綠素的含量也有所變化，表現(xiàn)為除β-胡蘿卜素和花粉黃質(zhì)在突變株中有所減少以外，其余的各種有色類胡蘿卜素在突變株Nfr-4中均有或多或少的升高，有的含量的升高十分顯著(如玉米黃質(zhì))?？?cè)~綠素和總有色類胡蘿卜素含量的比較分析表明突變株Nfr-4中的總?cè)~綠素和總有色類胡蘿卜素含量顯著高于野生型CC-137?？?cè)~綠素和總類胡蘿卜素含量的升高將會導(dǎo)致萊茵衣藻突變株Nfr一4的生長曲線發(fā)生改變。這些生理上的變化與相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表的關(guān)于Pd

4、s基因肩動子的上調(diào)突變的結(jié)果相一致，即與萊茵衣藻野生型CC-137相比，突變株具有生長時(shí)間長，細(xì)胞密度高的特點(diǎn)。 從萊茵衣藻的總DNA中PCR克隆萊茵衣藻野生型CC-137和突變株Nfr-4的Pds基因的啟動子，對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行的測序結(jié)果表明萊茵衣藻突變株Nfr-4 Pds基因啟動予的nt 428位發(fā)生了C→T的突變。 采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，以B-actin為參照基因(內(nèi)參)對萊茵衣藻的兩品系進(jìn)行相對

5、定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明萊茵衣藻突變株Nfr-4的Pds基因所表達(dá)的mRNA的量經(jīng)成組數(shù)據(jù)t-檢驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平顯著高于萊茵衣藻野生型CC-137。證明了很可能是啟動子的C→T突變提高了Pds基因在突變株Nfr-4中的表達(dá)量。 通過實(shí)驗(yàn)證明了本文所用的萊茵衣藻突變株Nfr-4為Pds基因啟動子突變株，有關(guān)Pds基因啟動子突變而賦予突變株以達(dá)草滅抗性的相關(guān)報(bào)道只在藍(lán)細(xì)菌中報(bào)道過，并且目前國內(nèi)外尚未得到其它萊茵衣藻Pds基因的突變