NO與CO調(diào)節(jié)萊茵衣藻銅鐵脅迫.pdf

1、銅是有機體生長所必需的元素，但在越來越多的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用中銅已經(jīng)成為環(huán)境污染的只要來源之一。過量的銅會誘導(dǎo)植物和綠藻產(chǎn)生過量的活性氧，進(jìn)而影響植物和綠藻的生長與代謝;為了應(yīng)對銅脅迫有機體會產(chǎn)生一些對抗機制，其中之一就是積累大量脯氨酸。盡管如此，銅脅迫下植物和綠藻的生理生化過程尚知之甚少。一氧化氮(NO)作為信號分子能夠介導(dǎo)多種生物和非生物脅迫誘導(dǎo)的生理反應(yīng)。本文研究了萊茵衣藻內(nèi)銅誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生與脯氨酸合成之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，被測

2、試藻暴露在低銅濃度下（2.5 and5.0μM Cu2+）積累了大量的脯氨酸。同時還觀察到隨著供銅濃度的增加細(xì)胞內(nèi)外NO的濃度也伴隨著相應(yīng)的增多。數(shù)據(jù)分析表明萊茵衣藻在銅脅迫下內(nèi)源NO的產(chǎn)生與脯氨酸水平的變化成正相關(guān)。通過分別添加NO特殊供體SNP與NO捕獲劑cPTIO確定NO參與脯氨酸的積累。銅處理的藻細(xì)胞經(jīng)10μM SNP預(yù)處理后其脯氨酸的積累增加了1.5倍，同時添加10μM cPTIO能阻止這種影響。進(jìn)一步研究銅和NO對脯氨酸合成

3、中的關(guān)鍵酶△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS，EC2.7.2.11)活性與轉(zhuǎn)錄量的影響，發(fā)現(xiàn)銅處理的衣藻中SNP的應(yīng)用能激發(fā)P5CS的活性并上游調(diào)控P5CS基因的表達(dá)，相反，cPTIO卻能抑制這種現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示萊茵衣藻內(nèi)銅脅迫響應(yīng)的脯氨酸合成與NO的產(chǎn)生密切相關(guān)，進(jìn)而表明NO在重金屬銅脅迫下脯氨酸代謝中的調(diào)控作用。
　　 鐵同樣是植物和綠色藻類生長所必需的營養(yǎng)元素，但是由于外界Fe(Ⅲ)的不可利用性及植物和綠藻對鐵吸收效

4、率普遍不高，導(dǎo)致植物與綠藻經(jīng)常出現(xiàn)缺鐵癥狀，即萎黃癥。因此怎樣調(diào)控這一生理病癥是個亟待解決的問題。CO是動物體內(nèi)的內(nèi)生性氣體分子并調(diào)控一系列的生理生化進(jìn)程，但是CO是否也調(diào)控植物與微藻體內(nèi)的營養(yǎng)脅迫響應(yīng)則研究甚少。本文研究了缺鐵狀態(tài)下萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)CO對鐵平衡的調(diào)控。發(fā)現(xiàn)8μM的外源性CO能夠阻止缺鐵引起的萎黃癥并能提高細(xì)胞葉綠素的積累，使衣藻恢復(fù)綠色，并且衣藻葉綠體片層結(jié)構(gòu)也在加入外源CO后清晰可見。而CO更能上游調(diào)控缺鐵狀態(tài)下衣藻細(xì)

5、胞中FTR1，F(xiàn)d, FOX1等與鐵吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因的表達(dá)。外源性CO還能夠提高缺鐵細(xì)胞的鐵含量。
　　 胞內(nèi)CO的產(chǎn)生與血紅素氧化酶heme oxygenase1(HO-1，EC1.14.99.3)密切相關(guān)。血紅素氧化酶能夠催化血紅素分解成CO，亞鐵離子和膽綠素。研究表明缺鐵誘導(dǎo)萊茵衣藻內(nèi)HO-1基因的表達(dá)，說明內(nèi)源CO可能參與萊茵衣藻缺鐵響應(yīng)過程。我們測定了缺鐵狀態(tài)下HO-1，F(xiàn)OX1等酶的活性，發(fā)現(xiàn)這些酶活性都被誘導(dǎo)提高

6、。
　　 為了更深入地證明HO-1及CO緩解缺鐵脅迫的作用，我們構(gòu)建了萊茵衣藻HO-1過表達(dá)載體，和作為對比的HO-1敲除載體，并先后獲得能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。對缺鐵狀態(tài)下的轉(zhuǎn)基因衣藻進(jìn)行一系列生理生化及分子功能鑒定后，發(fā)現(xiàn)HO-1過表達(dá)藻株能夠完全抑制失綠現(xiàn)象，且包括HO-1在內(nèi)的一些關(guān)鍵基因都能高效表達(dá)，酶活測定也顯示HO-1與FOX1酶活力增加。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HO-1過表達(dá)藻體的葉綠體片層結(jié)構(gòu)在鐵缺乏情況下始終清晰可見，

7、與正常藻細(xì)胞差別不大。而HO-1敲除轉(zhuǎn)化子不能使藻細(xì)胞恢復(fù)綠色，葉綠素片層結(jié)構(gòu)也不完整并遭到嚴(yán)重破壞。
　　 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，添加外源性CO后正常生長的萊茵衣藻在鐵缺乏狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的NO水平有所提高;同樣的HO-1轉(zhuǎn)基因衣藻在缺鐵條件下其細(xì)胞內(nèi)的NO水平也顯著提高，這兩種現(xiàn)象都能夠通過添加NO捕獲劑cPTIO得到逆轉(zhuǎn)，說明CO的調(diào)控作用需要NO的參與并有可能受到NO的上游調(diào)控。本研究表明CO能夠提高萊茵衣藻對缺鐵的耐受性，并在缺