沼澤紅假單胞菌hupL缺失突變株構(gòu)建及產(chǎn)氫特性研究.pdf

1、當今世界能源危機與環(huán)境污染日益嚴重，可再生清潔能源的開發(fā)和利用已得到世界范圍的重視。氫能源的清潔可再生使得它成為未來的理想替代能源。生物制氫技術(shù)反應條件溫和、能耗低，其中既能利用太陽能產(chǎn)氫又可凈化處理有機廢水的光合細菌制氫技術(shù)是一種有效可行的綠色氫能生產(chǎn)技術(shù)。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)是目前國內(nèi)外比較常用的光合產(chǎn)氫模式菌株。
　　 本文從環(huán)境中分離純化了2株沼澤紅假單胞菌，通過基因改造

2、構(gòu)建出吸氫酶大亞基hupL基因缺失突變株，進行了野生菌株和突變菌株的生長及產(chǎn)氫特性研究，以期突變株氫氣產(chǎn)量獲得提高并為污水治理提供優(yōu)良菌種資源。
　　 研究結(jié)果如下：
　　 ①分離純化鑒定，最終獲得R.palustris專利菌株。分別從湖底及江邊污泥取樣，利用光合細菌富集培養(yǎng)基進行富集，再用分離培養(yǎng)基對已得菌株進行分離純化，得到2株純化菌株，通過生理生化與分子生物學方法鑒定，兩菌株同為R.palustris，分別命名為R

3、.palustris CQU01和R.palustris CQU02。16S rDNA分子鑒定結(jié)果顯示二者分別與R.palustris strain：LW-RE和R.palustris strain：TUT3620有著97％和98％的相似度。
　　 ②構(gòu)建并鑒定了R.palustris hupL靶向性自殺載體。利用R.palustris CQU01作為出發(fā)菌株，PCR擴增hupL兩側(cè)的基因片段hupS、hupC作為雙交換時的交換

4、臂，連入pMD18-T載體進行測序驗證，pSUP202載體上含有HindⅢ和SalⅠ酶切位點，通過HindⅢ和SalⅠ雙酶切并回收大片段載體，將兩目的基因擴增產(chǎn)物與大片段載體連接形成前自殺載體‘pSUP202-hupSC'。pUC4K載體通過$se8387I將Kmr cassette片段基因切下，前自殺載體同樣使用Sse8387I切開，去磷酸化處理。將Kmr cassette片段連入前自殺載體，構(gòu)建出pBPZ自殺載體。
　　 ③

5、構(gòu)建并鑒定了沼澤紅假單胞菌hupL缺失突變株。將自殺載體pBPZ轉(zhuǎn)入E.coli S17-1，獲得接合供體菌，將處于生長對數(shù)期的供體菌E.coli S17-1和出發(fā)菌(受體菌)R.palustris CQU01以1∶3的比例混合進行接合培養(yǎng)，pBPZ通過接合作用轉(zhuǎn)入R.palustris CQU01。具有Km抗性的目的菌株在含抗生素的RCVBN平板上得以篩選。對陽性菌株進行傳代20次，每隔2代進行一次PCR檢測，以驗證突變株穩(wěn)定性。使用

6、亞甲基蘭顯色法對突變菌株進行吸氫酶活性測定，結(jié)果得到的陽性突變株R.palustris CQU012穩(wěn)定性較好，吸氫酶活性降低明顯。
　　 ④生長及產(chǎn)氫特性研究。分別對野生菌和突變菌的生長及產(chǎn)氫特性進行測定比較。兩者生長特性無顯著區(qū)別，突變菌R.palustris CQU012生長對數(shù)期稍長。另外突變菌產(chǎn)氫量有明顯提高，R.palustris CQU01每1L培養(yǎng)物在216h內(nèi)共產(chǎn)生約350ml氫氣，而相同條件下R.palust