一株假單胞菌尼古丁降解相關(guān)酶的初步研究.pdf

1、煙草中的主要生物堿尼古丁，是一種精神藥品，由于人類長(zhǎng)期的吸食習(xí)慣，導(dǎo)致了對(duì)煙草中尼古丁的依賴，同時(shí)吸煙和煙氣環(huán)境嚴(yán)重威脅人類的健康；煙草加工過程產(chǎn)生了含高濃度的尼古丁的廢物，這些都屬于有毒的污染物，因此有效地控制卷煙和環(huán)境中的尼古丁的含量，對(duì)于維護(hù)人類健康有著深遠(yuǎn)的意義。由于某些微生物具有降低煙草中尼古丁含量的作用，有關(guān)微生物代謝尼古丁的研究逐漸引起了微生物學(xué)者和煙草研究人員的關(guān)注。但有關(guān)這方面的研究主要集中在細(xì)菌的兩個(gè)屬：假單胞菌屬和

2、節(jié)桿菌屬。其中，對(duì)氧化節(jié)桿菌(Arthrobactel oxidans)作了較系統(tǒng)的研究，闡明了它的代謝途徑，涉及到的酶及基因序列己基本清楚；但對(duì)于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)細(xì)菌，只初步分析了代謝途徑，相關(guān)的酶學(xué)證據(jù)、酶和基因方面的研究還沒有進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過前期的工作獲得一株可以降解尼古丁的假單胞菌株S16，并純化了代謝途徑中的兩種中間產(chǎn)物3-琥珀酰吡啶 (3-Succinoyl pyridine,SP)和6-羥基

3、-3-琥珀酰吡啶(6-Hvdroxy-3-succinoylpyridine，HSP)。本論文的工作中，以該假單胞菌株和上述的2種中間產(chǎn)物為研究對(duì)象，對(duì)粗酶液作用下的這兩種化合物的反應(yīng)開展初步研究。 以假單胞菌S16的粗酶液為催化劑，SP和HSP依次為底物，檢測(cè)生成的產(chǎn)物，進(jìn)一步確定反應(yīng)時(shí)底物SP和產(chǎn)物HSP，底物HSP和產(chǎn)物2,5-二羥基吡啶(2,5-DihydroxypyTidine,DHP)之間量的關(guān)系，結(jié)果證明SP在S1

4、6粗酶液作用下生成HSP，而HSP繼續(xù)反應(yīng)生成DHP和琥珀酸，進(jìn)一步從酶學(xué)角度驗(yàn)證了代謝途徑中的這兩步反應(yīng)。 為獲得更多的細(xì)胞催化劑，優(yōu)化S16的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇不同的碳氮源，并通過綜合考慮休止細(xì)胞對(duì)尼古丁的降解活性和獲得的細(xì)胞量來確定外加碳氮源的種類和比例，經(jīng)過優(yōu)化確定以葡萄糖為碳源，濃度1％，硫酸銨為氮源，濃度0.4％，尼古丁濃度為lmg/ml，在生長(zhǎng)12h后其OD<,620nm>?？蛇_(dá)到7.0左右，細(xì)胞的活性與未添加葡萄糖

5、和硫酸銨的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的細(xì)胞基本一致。在該優(yōu)化條件下，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SP、HsP和DHP對(duì)假單胞菌S16的酶系的誘導(dǎo)作用，結(jié)果沒有加入誘導(dǎo)物的粗酶液對(duì)這幾種化合物都沒有活性，加入誘導(dǎo)物后粗酶液出現(xiàn)了對(duì)這三種中間物的降解能力，但不能降解尼古丁。 由于尼古丁、SP、HSP和DHP在結(jié)構(gòu)上的相似性，不能直接通過分光光度計(jì)法測(cè)定。首先建立了的各自的檢測(cè)方法，在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化各反應(yīng)條件，如pH、溫度、反應(yīng)所需的輔因子等，在對(duì)各酶進(jìn)行了初步