油桐種子轉(zhuǎn)錄組解析及油脂合成重要基因克隆.pdf

1、油桐原產(chǎn)中國，與油茶、核桃、烏桕并稱我國四大木本油料植物，其種子可用來制取桐油，曾經(jīng)是一種世界最著名的制造高檔油漆和油墨的優(yōu)質(zhì)原料，也是制造生物柴油的重要原料，還是制造新型復(fù)合功能材料的重要原料，具有很高的經(jīng)濟利用價值。研究油桐種子中油脂合成的機理不僅能為木本植物油脂積累的研究奠定重要的理論基礎(chǔ)，還可能利用克隆的重要基因?qū)τ屯┻M行分子遺傳改良，從而大幅度提高桐油的單位面積產(chǎn)量，提高桐油品質(zhì)及其對不良環(huán)境的抗逆能力。以往的研究大都集中于傳

2、統(tǒng)的栽培和育種方面，相關(guān)的分子生物學(xué)研究還不夠深入，沒有涉及到基因的功能研究，這遠遠不能適應(yīng)油桐遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和育種學(xué)的種種需求。造成這一局限性的原因是缺少有用的參考基因序列信息。本研究利用Illumina測序技術(shù)分別在6月、8月、10月對油桐處于不同發(fā)育時期種子的轉(zhuǎn)錄組進行測序，對3個不同時期種子的轉(zhuǎn)錄組進行比較分析、基因表達差異分析、和油脂合成代謝等代謝途徑解析;在此基礎(chǔ)上，對FATA基因和KASⅢ基因進行了基因克隆和功能研究，

3、主要研究結(jié)果如下:
　　1、油桐種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的序列組裝、基因功能注釋和分類。對Ⅰ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中52，039，198個clean reads進行組裝后獲得98，909個contigs和61，001個Unigene，其中長度在75-200nt范圍內(nèi)的Contig片段有54，918條。對Ⅱ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中51，886，702個clean reads進行組裝后獲得87，848個contigs和54，679個Unigene，其中長度在75-

4、200nt范圍內(nèi)的Contig片段有47，735條。對Ⅲ期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中52，734，436個clean reads進行組裝后獲得69，253個contigs和44，495個Unigene，其中長度在75-200nt范圍內(nèi)的Contig片段有34，274條。對相關(guān)cDNA序列進行基因注釋，共有41，059條Unigene序列能夠與公共數(shù)據(jù)庫中的已知基因匹配，占所有非冗余基因的70.3％。3個不同時期的油桐種子轉(zhuǎn)錄組共有26，625條Uni

5、gene與COG數(shù)據(jù)庫中的基因具有同源性，這些Unigene根據(jù)預(yù)測的功能可分為25類。GO分類將油桐3個轉(zhuǎn)錄組的30，280個非冗余Unigene(占Unigene總數(shù)的51.8％)歸類于61個組。KEGG的PATHWAY數(shù)據(jù)庫對油桐種子油脂合成不同時期的3個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了詳細(xì)的解析，將非冗余基因歸于128個代謝途徑。
　　2、油桐種子油脂合成代謝途徑基因表達模式解析。將油桐種子3個不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組進行兩兩比較后，對差異表

6、達Unigene進行GO分析并分別歸類于57(Ⅱ vsⅠ)、59(Ⅲ vsⅡ)和61(Ⅲ vsⅠ)個組，同時將獲得的差異表達Unigene分別歸于126(Ⅱ vsⅠ)、127(Ⅲ vsⅡ)和127(Ⅲ vsⅠ)個代謝途徑。對3個時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行Pathway富集性分析發(fā)現(xiàn)共有54個Unigene可歸類于脂肪酸生物合成途徑，占所有非冗余Unigene的0.24％。將54個Unigene序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中比對后獲得14個與其它物種同

7、源的脂肪酸合成相關(guān)基因并對這些基因在油桐油脂合成期的表達模式進行了分析。對3個時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行Pathway富集性分析發(fā)現(xiàn)共有428個Unigene可歸類于甘油磷脂代謝途徑，占所有非冗余Unigene的1.93％。將428個Unigene序列在KEGG數(shù)據(jù)庫中比對后獲得31個與其他物種同源的甘油磷脂代謝相關(guān)基因并對這些基因在油桐油脂合成期的表達模式進行了分析。
　　3、油桐FATA基因的克隆與功能研究。通過RACE技術(shù)克隆了長

8、度為1480 bp的油桐FATA基因的全長cDNA序列，并在此基礎(chǔ)上利用PCR技術(shù)克隆了FATA基因的CDS序列和基因組序列，長度分別為1113 bp和3801 bp。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，油桐FATA蛋白質(zhì)序列與其它植物的FATA序列之間具有較高的同源性，這證實了我們克隆出的基因確實是油桐的FATA基因。系統(tǒng)演化分析發(fā)現(xiàn)，油桐FATA與麻風(fēng)樹FATA的親緣關(guān)系最近，其次是蓖麻（Ricinus communis）FATA，而與蒺藜狀苜蓿FA

9、TA的親緣關(guān)系最遠。通過Southern雜交分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATA基因在油桐基因組中以單拷貝形式存在。油桐FATA基因在根、葉和種子中都有表達，其中在葉、子葉和幼根中的表達量無明顯差異，而在種子中，表達量隨著種子的發(fā)育逐漸升高，且在Ⅰ期即油脂剛開始合成時的表達量高于葉、子葉和幼根中的表達量。利用TAIL-PCR技術(shù)克隆了油桐FATA基因的啟動子，為后續(xù)基因的表達調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。
　　4、油桐KASⅢ基因的克隆與功能研究。同樣，通過

10、RACE技術(shù)克隆了長度為1651 bp的油桐KASⅢ基因的全長cDNA序列。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，油桐KASⅢ蛋白質(zhì)序列與其它植物的KASⅢ序列之間具有較高的同源性。系統(tǒng)演化分析發(fā)現(xiàn)，油桐KASⅢ與麻風(fēng)樹和蓖麻KASⅢ的親緣關(guān)系較近。表達模式研究表明，油桐KASⅢ基因在根、葉和種子中都有表達，其中在葉、子葉和幼根中的表達量無明顯差異，而在種子中，表達量隨著種子的發(fā)育逐漸升高，且在Ⅰ期即油脂剛開始合成時的表達量高于葉、子葉和幼根中的表達量。<