幽門螺桿菌CagM、CagI蛋白的生物信息學(xué)分析.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是目前發(fā)現(xiàn)唯一能夠在人胃內(nèi)定植、生存的微需氧革蘭氏陰性桿菌。是世界性分布的病原菌，也是目前人類發(fā)生率最高的慢性細(xì)菌感染之一，全世界范圍內(nèi)感染率超過(guò)50％。來(lái)自世界各地的流行病學(xué)研究證實(shí)，H.pylori感染是消化性潰瘍和慢性胃炎的重要病因，并與胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)，1994年世界衛(wèi)生組織已將其列為Ⅱ類致癌原。cag致病島編碼的Ⅳ型

2、分泌系統(tǒng)是幽門螺桿菌的一個(gè)重要致病因素，通過(guò)此分泌系統(tǒng)cag致病島可將其唯一效應(yīng)分子CagA轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞并發(fā)揮其毒性作用。目前，cag致病島編碼基因的生物學(xué)功能及其參與H.pylori致病的機(jī)制尚未明確，因此，本文以cag致病島中的cagM、cagI基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)分子生物學(xué)、微生物學(xué)及生物信息學(xué)等技術(shù)探討H.pylori cagM、cagI基因的結(jié)構(gòu)和功能，以指導(dǎo)以后的實(shí)驗(yàn)研究，為更深入研究cag致病島的致病機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。<

3、br>　　方法:
　　1.根據(jù)GenBank中已報(bào)道的H.pylori22695的全基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件Primer5.0自行設(shè)計(jì)cagM、cagI基因引物，獲得H.pylori cagM、cagI基因。
　　2.cagM、cagI基因T-A克隆后構(gòu)建pGEM-T-cagM，pMD18-T-cagI載體，并進(jìn)行序列測(cè)定。
　　3.cagM、cagI基因測(cè)序結(jié)果提交GenBank，獲得基因庫(kù)登錄號(hào)。
　　

4、4.運(yùn)用DNAstar V7.1軟件和ANTHEPROT5.0軟件分析CagM、CagI蛋白基本性質(zhì)，包括:氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)、疏水性、親水性、抗原性等。
　　5.利用生物信息學(xué)軟件分析H.pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性。
　　6.運(yùn)用ANTHEPROT5.0軟件和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)等分析預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)，用PROSITESCAN和Fingerprint分析推測(cè)其潛在的功能，包括蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽

5、和剪切位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、蛋白家族、蛋白質(zhì)指紋圖譜等。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用PCR技術(shù)成功克隆了H.pylori cagM、cagI基因。
　　2.cagM、cagI基因T-A克隆后測(cè)序，基因測(cè)序結(jié)果表明:H.pyloriNCTC11637cagM基因全長(zhǎng)1149bp（GenBank基因庫(kù)登錄號(hào)為:GU269568），與設(shè)計(jì)序列大小完全一致，編碼376個(gè)氨基酸;H.pylori NCTC

6、11637cagI基因全長(zhǎng)1086bp(GenBank基因庫(kù)登錄號(hào)為:HM126476)，與設(shè)計(jì)序列大小完全一致，編碼361個(gè)氨基酸。
　　3.CagM、CagI基本性質(zhì)分析:CagM蛋白有376個(gè)氨基酸，分子量為43.76kD，理論等電點(diǎn)為9.3，有多個(gè)疏水區(qū)域和親水區(qū)域，有多個(gè)抗原決定簇;CagI蛋白有361個(gè)氨基酸，分子量為39.37kD，理論等電點(diǎn)為5.56，疏水性不是很強(qiáng)，接近兩親性，親疏水區(qū)域間隔分布，有多個(gè)明顯的具有

7、抗原活性的結(jié)構(gòu)域。
　　4.H.pylori cagM、cagI基因核苷酸序列及蛋白序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn):H.pylori cagM、cagI核苷酸序列與GenBank中已知的其他H.pylori菌株cagM、cagI的核苷酸序列同源性分別為96～99％和95～99％;將核苷酸序列按標(biāo)準(zhǔn)密碼子翻譯成蛋白質(zhì)后，其氨基酸序列與其他H.pylori菌株氨基酸序列同源性分別為98～99％和96～99％。
　　5.CagM、CagI

8、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析: CagM蛋白N端20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，有一段跨膜區(qū)，剪切位點(diǎn)在第20個(gè)和第21個(gè)氨基酸之間，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)中螺旋結(jié)構(gòu)為主體，CagM蛋白定位于細(xì)菌周質(zhì)空間;CagI蛋白N端20個(gè)氨基酸亦為信號(hào)肽，有三段跨膜區(qū)，剪切位點(diǎn)亦在第20個(gè)和第21個(gè)氨基酸之間，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)中螺旋結(jié)構(gòu)亦為主體，CagI蛋白是定位于外膜。
　　6.CagM、CagI功能預(yù)測(cè)分析:CagM屬于蛋白水解酶家族，有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是多種激酶

9、的底物，有糖基化位點(diǎn)和豆蔻化位點(diǎn)，通過(guò)翻譯后剪切修飾，形成有功能的蛋白，在細(xì)菌周質(zhì)空間行使信號(hào)傳遞和集裝Ⅳ型分泌系統(tǒng)中其他蛋白的功能;CagI為穩(wěn)定的疏水蛋白，保守性很強(qiáng)，有N-糖基化作用位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和豆蔻酰化作用位點(diǎn)，有膜蛋白、菌毛蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、水解酶、ATP/GTP酶、微管蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、錨蛋白、分泌系統(tǒng)蛋白等多個(gè)蛋白標(biāo)簽。
　　結(jié)論:
　　1.成功克隆了H.pylori ca

10、g致病島中的cagM、cagI基因。
　　2.獲得了CagM、CagI蛋白的大部分理化特征數(shù)據(jù)，包括:氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)、疏水性、親水性、抗原性等。
　　3.H.pylori cagM、cagI核苷酸序列及蛋白序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)cagM、cagI基因作為H.pylori cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因之一，其核苷酸序列及氨基酸序列相對(duì)保守，說(shuō)明二者在幽門螺桿菌致病過(guò)程中具有重要作用。
　　4.應(yīng)用生