食管癌外泌體介導(dǎo)的惡性表型研究及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MTA1)相關(guān)外泌體的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、目的:探討食管癌外泌體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞之間的惡性表型傳遞以及MTA1對(duì)食管癌細(xì)胞外泌體特性及蛋白成分影響。
　　方法:采用差速超速離心法提取KYSE410細(xì)胞外泌體，通過透射電鏡及免疫印跡法(Western blotting)觀察所獲得的外泌體的形態(tài)及其標(biāo)志物;共聚焦顯微鏡觀察KYSE410、KYSE510和YES2細(xì)胞攝取熒光染料標(biāo)記的KYSE410外泌體;分別采用transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢

2、驗(yàn)KYSE410細(xì)胞外泌體對(duì)3種食管癌細(xì)胞遷移、侵襲、增殖和克隆形成的影響;免疫印跡法檢測Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化。分別對(duì)MTA1共表達(dá)基因和MTA1 Co-IP質(zhì)譜相互作用蛋白作聚類分析;Nanosight檢測不同MTA1表達(dá)水平的食管癌細(xì)胞分泌的外泌體粒徑大小;Label-free質(zhì)譜方法檢測不同MTA1表達(dá)水平的食管癌細(xì)胞的外泌體蛋白并對(duì)差異蛋白作GO功能聚類分析;通過CCLE數(shù)據(jù)庫和cB

3、ioPortal平臺(tái)數(shù)據(jù)分析MTA1和目標(biāo)差異蛋白在組織、細(xì)胞水平的相關(guān)性;分析目標(biāo)差異蛋白與臨床病理特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果:透射電鏡可以觀察到具有膜結(jié)構(gòu)的外泌體;免疫印跡方法能夠檢測到外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD81;3種細(xì)胞均能夠成功攝取熒光染料標(biāo)記的KYSE410外泌體;3種食管癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力從大到小依次為KYS E410、KYSE510、YES2，KYSE410外泌體能夠促進(jìn)3種食管癌細(xì)胞遷移、侵襲及克隆形成，但

4、不影響3種食管癌細(xì)胞的增殖;外泌體處理能夠增強(qiáng)3種食管癌細(xì)胞中β-catenin和p-Akt的表達(dá)。MTA1共表達(dá)基因聚類分析顯示MTA1影響囊泡組織與生物合成;MTA1 Co-IP質(zhì)譜相互作用蛋白聚類分析顯示絕大多數(shù)MTA1相互作用蛋白在外泌體中有定位;不同MTA1表達(dá)水平的KYS E410細(xì)胞和KYSE450細(xì)胞分泌的外泌體的大小和數(shù)量沒有顯著差異;首次鑒定出25個(gè)新的外泌體蛋白成分;CytoScape軟件分析兩組外泌體蛋白連接度最

5、高的節(jié)點(diǎn)均在UBC蛋白;對(duì)照/敲除MTA1的KYSE410細(xì)胞獲得外泌體蛋白和對(duì)照/過表達(dá)KYSE450細(xì)胞獲得的外泌體蛋白都主要定位在胞漿、細(xì)胞核、溶酶體、質(zhì)膜等部位，主要的分子功能包括催化活性、分子伴侶活性、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合、GTPase活性等，主要影響的生物學(xué)進(jìn)程包括蛋白代謝、能量通路、細(xì)胞生長和維持、免疫反應(yīng)等;廣泛參與整聯(lián)蛋白家族細(xì)胞表面相互作用、β1整聯(lián)蛋白細(xì)胞表面相互作用、蛋白多糖syndecan介導(dǎo)的信號(hào)事件等;對(duì)照/敲

6、除MTA1的KYSE410細(xì)胞和對(duì)照/過表達(dá)KYSE450細(xì)胞的外泌體內(nèi)MTA1調(diào)控的差異蛋白共同參與大分子代謝負(fù)調(diào)控、磷酸鹽代謝、大分子分解代謝等生物學(xué)進(jìn)程;MYH9、SLC7A5和CCT4均與MTA1在組織水平有中等強(qiáng)度相關(guān)性;MYH9、CCT4和食管癌病人T分期、臨床分期有相關(guān)性;SLC7A5、CCT4高表達(dá)的食管癌病人總生存時(shí)間更短。
　　結(jié)論:高侵襲性食管癌細(xì)胞KYSE410來源的外泌體能夠促進(jìn)自身以及食管癌KYSE51