食管癌外泌體介導的惡性表型研究及腫瘤轉移相關基因1(MTA1)相關外泌體的定量蛋白質組學分析.pdf

1、目的:探討食管癌外泌體介導的腫瘤細胞之間的惡性表型傳遞以及MTA1對食管癌細胞外泌體特性及蛋白成分影響。
　　方法:采用差速超速離心法提取KYSE410細胞外泌體，通過透射電鏡及免疫印跡法(Western blotting)觀察所獲得的外泌體的形態(tài)及其標志物;共聚焦顯微鏡觀察KYSE410、KYSE510和YES2細胞攝取熒光染料標記的KYSE410外泌體;分別采用transwell實驗、劃痕愈合實驗、細胞增殖實驗、克隆形成實驗檢

2、驗KYSE410細胞外泌體對3種食管癌細胞遷移、侵襲、增殖和克隆形成的影響;免疫印跡法檢測Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信號通路相關蛋白的變化。分別對MTA1共表達基因和MTA1 Co-IP質譜相互作用蛋白作聚類分析;Nanosight檢測不同MTA1表達水平的食管癌細胞分泌的外泌體粒徑大小;Label-free質譜方法檢測不同MTA1表達水平的食管癌細胞的外泌體蛋白并對差異蛋白作GO功能聚類分析;通過CCLE數據庫和cB

3、ioPortal平臺數據分析MTA1和目標差異蛋白在組織、細胞水平的相關性;分析目標差異蛋白與臨床病理特征的相關性。
　　結果:透射電鏡可以觀察到具有膜結構的外泌體;免疫印跡方法能夠檢測到外泌體標志蛋白CD63和CD81;3種細胞均能夠成功攝取熒光染料標記的KYSE410外泌體;3種食管癌細胞的遷移及侵襲能力從大到小依次為KYS E410、KYSE510、YES2，KYSE410外泌體能夠促進3種食管癌細胞遷移、侵襲及克隆形成，但

4、不影響3種食管癌細胞的增殖;外泌體處理能夠增強3種食管癌細胞中β-catenin和p-Akt的表達。MTA1共表達基因聚類分析顯示MTA1影響囊泡組織與生物合成;MTA1 Co-IP質譜相互作用蛋白聚類分析顯示絕大多數MTA1相互作用蛋白在外泌體中有定位;不同MTA1表達水平的KYS E410細胞和KYSE450細胞分泌的外泌體的大小和數量沒有顯著差異;首次鑒定出25個新的外泌體蛋白成分;CytoScape軟件分析兩組外泌體蛋白連接度最

5、高的節(jié)點均在UBC蛋白;對照/敲除MTA1的KYSE410細胞獲得外泌體蛋白和對照/過表達KYSE450細胞獲得的外泌體蛋白都主要定位在胞漿、細胞核、溶酶體、質膜等部位，主要的分子功能包括催化活性、分子伴侶活性、細胞骨架蛋白結合、GTPase活性等，主要影響的生物學進程包括蛋白代謝、能量通路、細胞生長和維持、免疫反應等;廣泛參與整聯(lián)蛋白家族細胞表面相互作用、β1整聯(lián)蛋白細胞表面相互作用、蛋白多糖syndecan介導的信號事件等;對照/敲

6、除MTA1的KYSE410細胞和對照/過表達KYSE450細胞的外泌體內MTA1調控的差異蛋白共同參與大分子代謝負調控、磷酸鹽代謝、大分子分解代謝等生物學進程;MYH9、SLC7A5和CCT4均與MTA1在組織水平有中等強度相關性;MYH9、CCT4和食管癌病人T分期、臨床分期有相關性;SLC7A5、CCT4高表達的食管癌病人總生存時間更短。
　　結論:高侵襲性食管癌細胞KYSE410來源的外泌體能夠促進自身以及食管癌KYSE51