大蒜素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞作用效果的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景 骨肉瘤是常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，由于腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，使各種治療手段均難以達(dá)到根治程度。1970年以前標(biāo)準(zhǔn)治療是截肢術(shù)，但5年生存率僅約為10％。近30年來(lái)，隨著新輔助化療的廣泛應(yīng)用，骨肉瘤的5年生存率已達(dá)60％。我國(guó)目前未行術(shù)前化療者復(fù)發(fā)率在30％左右，應(yīng)用術(shù)前化療后60％～70％患者得以保肢。一些研究還表明，新輔助化療聯(lián)合保肢手術(shù)治療后的患者，其5年生存率可達(dá)70％。而我們的臨床研究也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用新輔助

2、化療和保肢手術(shù)治療后(隨訪時(shí)間平均為47個(gè)月)，患者的無(wú)瘤生存率為54.5％。因此，盡管化療在骨肉瘤治療中具有舉足輕重的地位并取得了可喜的成就，但是骨肉瘤化療總體有效率仍徘徊在60％左右。制約其療效的主要因素在于兩個(gè)方面，一是高劑量強(qiáng)度化療藥物所導(dǎo)致的嚴(yán)重毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、心臟毒性、肝臟毒性、腎臟及膀胱毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、過(guò)敏反應(yīng)及皮膚毒性、肺部不良反應(yīng)等；二是腫瘤細(xì)胞原發(fā)或繼發(fā)的耐藥問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)和選用毒副作用低、骨

3、肉瘤細(xì)胞沒(méi)有耐藥性或耐藥性較低的藥物成為當(dāng)前骨肉瘤化療新的突破點(diǎn)。 大蒜素(diallyl trisulfide，DATS，化學(xué)名二烯丙基三硫化物)，是從粉碎新鮮大蒜中提取的一種有機(jī)硫化合物，具有良好的抗腫瘤作用。許多研究結(jié)果表明，大蒜素抗腫瘤的作用機(jī)理主要是兩個(gè)方面：停滯細(xì)胞周期和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期依賴性激酶(Cdks)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclins)的調(diào)節(jié)來(lái)阻止細(xì)胞有絲分裂、停滯細(xì)胞周期；通過(guò)線粒體信號(hào)途徑

4、(主要是影響B(tài)cl-2家族)、鈣離子信號(hào)途徑、氧化應(yīng)激途徑來(lái)激活caspase活性，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的。但是就目前的研究來(lái)看，針對(duì)大蒜素的應(yīng)用似乎局限于了腺上皮來(lái)源的癌，沒(méi)有相關(guān)的資料證明大蒜素抑制腫瘤生長(zhǎng)有部位或組織來(lái)源的選擇性。因此，本課題以人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞為研究對(duì)象，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，以研究大蒜素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株的作用效果，并探討其抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)理。本研究首次將大蒜素應(yīng)用到治療骨肉

5、瘤的實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中，并用目前的熱點(diǎn)研究手段-蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)探討大蒜素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用機(jī)理，不僅拓展了大蒜素抗腫瘤的作用范圍，并可為藥物治療骨肉瘤提供新的研究方向。本研究大體可分為兩個(gè)部分：一、大蒜素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究目的盡管目前許多的研究已經(jīng)表明，大蒜素可通過(guò)停滯細(xì)胞周期和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的。但是就目前的研究來(lái)看，針對(duì)大蒜素的應(yīng)用似乎局限于了腺上皮來(lái)源的癌，沒(méi)有相關(guān)的資料證明大蒜

6、素抑制腫瘤生長(zhǎng)有部位或組織來(lái)源的選擇性。 本研究的目的就是以人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用各種不同的方法檢測(cè)大蒜素作用后，Saos-2細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)特征的變化，并通過(guò)這些變化來(lái)分析大蒜素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞增殖的抑制效果。 方法： 1倒置顯微鏡觀察不同濃度的大蒜素作用不同時(shí)間段后，Saos-2細(xì)胞形態(tài)變化。 2不同濃度的大蒜素作用于Saos-2細(xì)胞不同

7、時(shí)間段后，MTT法檢測(cè)大蒜素對(duì)細(xì)胞增值的抑制效果。 3不同濃度的大蒜素作用于Saos-2細(xì)胞不同時(shí)間段后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Saos-2細(xì)胞周期。 4不同濃度的大蒜素作用于Saos-2細(xì)胞不同時(shí)間段后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Saos-2細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1不同濃度的大蒜素作用不同時(shí)間段后，Saos-2細(xì)胞的形態(tài)變化將25μM，50μM，100μM大蒜素加入到人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞的培養(yǎng)基中，分別處理

8、24、48、72和96小時(shí)后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞排列規(guī)則，連接緊密，大小均勻，細(xì)胞形態(tài)及胞膜界限清晰，核呈圓形并位于細(xì)胞中央。而大蒜素組細(xì)胞之間連接減少，形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)部顆粒增多，部分細(xì)胞變圓、皺縮，胞膜外突，并出現(xiàn)脫落死亡細(xì)胞。隨著濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，上述改變更加明顯。 2.大蒜素對(duì)Saos-2細(xì)胞增殖的影響25μM，50μM，100μM大蒜素分別處理24、48、72和96小時(shí)后，MTT法檢測(cè)

9、細(xì)胞增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大蒜素對(duì)Saos-2細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，與空白組對(duì)比有顯著性差異，并且有濃度和時(shí)間的依賴性。 3大蒜素對(duì)Saos-2細(xì)胞周期的影響25μM，50μM，100μM大蒜素分別處理24、48、72和96小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，大蒜素可使Saos-2細(xì)胞停滯在G0/G1期，并且隨著濃度和時(shí)間的增加，停滯在G0/G1期的細(xì)胞比例也隨之增加。 4大蒜素對(duì)Saos-2細(xì)胞凋亡的影響25μM，50μ

10、M，100μM大蒜素分別處理24、48、72和96小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，大蒜素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且其作用效果有一定的濃度和時(shí)間相關(guān)性。 二、大蒜素抑制人骨肉瘤細(xì)胞株saos-2細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究 目的：通過(guò)大蒜素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究，我們可以得出這樣的結(jié)論，大蒜素可通過(guò)停滯細(xì)胞周期進(jìn)程和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以達(dá)到其抑制Saos-2細(xì)胞增殖的作用效果。 本研究的目的就

11、是運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從蛋白水平檢測(cè)、分析人骨肉瘤細(xì)胞周期和/或細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化，探討大蒜素抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖的分子作用機(jī)制。 方法： 1.50μM大蒜素作用于Saos-2細(xì)胞48小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白，雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional electrophoresis，2-DE)初步分析大蒜素作用前后的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。 2.切取表達(dá)變化顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)轉(zhuǎn)入質(zhì)譜分析，得出新的或已知的蛋白質(zhì)。

12、 結(jié)果： 1.雙向凝膠電泳從Saos-2細(xì)胞中提取的蛋白在2-DE上得到很好的解析。在2-DE圖像上，50μM大蒜素組和對(duì)照組Saos-2細(xì)胞總蛋白在相同的模式中電泳。2-DE圖像掃描后，ImageMaster 2D Platinum進(jìn)行分析，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組得到的總的點(diǎn)數(shù)分別為316±6(n=3)和310±3(n=3)。點(diǎn)容積3倍的變化，設(shè)定為顯著變化的界限。結(jié)果共有36個(gè)點(diǎn)被認(rèn)為是對(duì)大蒜素敏感的，其中22個(gè)點(diǎn)是下調(diào)的，1

13、4個(gè)點(diǎn)是上調(diào)的。 2質(zhì)譜分析切取36個(gè)對(duì)大蒜素敏感的點(diǎn)，胰蛋白酶消化后，轉(zhuǎn)入基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-TOF MS)。根據(jù)質(zhì)譜儀所得的數(shù)據(jù)，27個(gè)點(diǎn)與蛋白質(zhì)匹配，其中包括下調(diào)18個(gè)，上調(diào)9個(gè)。這些蛋白參與到許多細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程中，比如細(xì)胞生長(zhǎng)周期和凋亡、細(xì)胞構(gòu)架和基礎(chǔ)代謝、以及蛋白合成和分解等。 結(jié)論： 本課題首次將大蒜素應(yīng)用到治療骨肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中，以人骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2細(xì)胞為研究對(duì)象，

14、進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)大蒜素對(duì)細(xì)胞增值的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制Saos-2細(xì)胞的增殖，并有濃度和時(shí)間的依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大蒜素可使Saos-2細(xì)胞停滯在G0/G1期，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可使Saos-2細(xì)胞的一些蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，而這些蛋白在許多細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。 本研究表明，大蒜素可通過(guò)停滯細(xì)胞周期進(jìn)程和/或誘導(dǎo)細(xì)