人肺腺癌Anip973-NVB耐藥細(xì)胞系的建立及耐藥機制的研究.pdf

1、目的：建立人肺腺癌耐藥細(xì)胞模型Anip973/NVB，檢測其生物學(xué)特性并從基因和蛋白質(zhì)水平上探討其諾維本的耐藥機制。 方法：本研究應(yīng)用人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973，采用諾維本逐步增加劑量法，誘導(dǎo)建立人肺腺癌耐藥細(xì)胞模型Anip973/NVB，檢測其耐藥細(xì)胞系和親代細(xì)胞系的生物學(xué)特性；用基因芯片技術(shù)檢測兩細(xì)胞系間基因表達(dá)的差異；通過RT-PCR法驗證部分基因芯片結(jié)果及檢測傳統(tǒng)耐藥相關(guān)基因的表達(dá)；用2-DE技術(shù)初步分析其耐藥細(xì)胞系與

2、親代細(xì)胞系間蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，探討其諾維本的耐藥機制。 結(jié)果：1、本研究經(jīng)過24個月建立了人肺腺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)nip973/NVB。2、通過Anip973/NVB生物學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)：（1）光鏡及電子顯微鏡觀察，Anip973/NVB細(xì)胞與Anip973細(xì)胞比較細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈長偽足的多角形及體積增大；線粒體數(shù)量增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒．（2）與親代細(xì)胞相比Anip973/NVB細(xì)胞生長曲線的倍增時間無明顯差異；（3）細(xì)胞周期分析

3、發(fā)現(xiàn)：耐藥細(xì)胞系A(chǔ)nip973/NVB的G0-G1期細(xì)胞明顯增多，為62．90%，S期細(xì)胞明顯減少，為28．32%，而親代細(xì)胞系A(chǔ)nip973的上述各周期的百分比分別為53．73%、38．25%，兩種細(xì)胞系的G2-M期細(xì)胞無明顯變化；（4）經(jīng)MIT法測定Anip973/NVB細(xì)胞比較親代細(xì)胞的NVB半數(shù)致死濃度（IC50）增大至21．81倍，該耐藥細(xì)胞系同時對順鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、表阿霉素、氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、足葉乙甙等藥物也產(chǎn)生了

4、交叉耐藥，耐藥倍數(shù)分別為11．89、11．68、6．12、3．95、2．86、2．64、2．15，而對伊立替康、吉西他濱相對敏感，耐藥倍數(shù)分別為1．38、1．27（均P<0．05=（5）高效液相色譜法測定發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞中的藥物濃度明顯低于親代細(xì)胞。3、基因芯片結(jié)果表明，在檢測的21571對基因中，Anip973/NVB和Anip973細(xì)胞均有差異表達(dá)的基因143對，其中在Anip973/NVB細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的55對，下調(diào)的88對。在這1

5、43對基因中，已知功能的基因有77條，明確與腫瘤相關(guān)的基因21對，在這些基因中ANXA1、ABCC3、TIMP-3和部分細(xì)胞粘連相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了變化，這可能是導(dǎo)致諾維本耐藥的主要機制：4、通過RT-PCR檢測經(jīng)典的耐藥相關(guān)基因，結(jié)果顯示：MRP3及Bcl-2基因在耐藥細(xì)胞系中表達(dá)增高，而未發(fā)現(xiàn)MDR、MRP1、ABCG2、GSTp1基因在這兩種細(xì)胞系中的差異表達(dá)。5、通過雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)，篩選兩種細(xì)胞系表達(dá)差異的蛋白，獲

6、得了分辨率較高，重復(fù)性較好的2-DE圖譜。在親代細(xì)胞系中檢測到的平均蛋白質(zhì)點為806個，平均匹配率為77%；在耐藥細(xì)胞系中檢測到的平均蛋白質(zhì)點為711個，平均匹配率為78．33%。篩選出在兩種細(xì)胞系中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)37個，其中在耐藥細(xì)胞中上調(diào)的蛋白16個，下調(diào)的蛋白21個。查詢數(shù)據(jù)庫初步鑒定了17個蛋白。 結(jié)論：1、初步證明了Anip973/NVB細(xì)胞系是一個明確的多藥耐藥細(xì)胞模型，具有耐藥細(xì)胞的基本生物學(xué)特性。2、基因芯片結(jié)

7、果表明，Anip973/NVB的耐藥機制可能是ANXA1、ABCC3基因表達(dá)增強導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的降低；細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞分化趨向成熟，逃避了化療藥物的攻擊；3、RT-PCR證明ABCC3（MRP3）在Anip973/NVB細(xì)胞系中表達(dá)增高，與本實驗基因芯片結(jié)果符合，表明MRP3的過表達(dá)可能是Anip973/NVB細(xì)胞系耐藥的主要機制之一；Bcl-2的過表達(dá)也參與了該細(xì)胞系的耐藥；4、兩種細(xì)胞系部分差異蛋白鑒定