沉默SURVIVIN抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和逆轉(zhuǎn)化療耐藥性研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是危害人類健康的主要疾病之一，按病理類型分為非小細(xì)胞肺癌(NoneSmall Cell Lung Cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small Cell Lung Cancer, SCLC)。近10年來隨著對肺癌分子生物學(xué)進(jìn)行深入研究，針對EGFR(Epithelial GrowthFactor Receptor，表皮生長因子受體)、ALK（Anaplasticlymphoma Kinase，間變性淋巴瘤激

2、酶）融合蛋白的分子靶向藥物的臨床廣泛應(yīng)用，晚期非小細(xì)胞肺癌生存時間及生活質(zhì)量取得明顯的延長和提高，為NSCLC開辟了新的治療途徑。小細(xì)胞肺癌患者占全部肺癌的15～20％，SCLC的生物學(xué)特征:腫瘤細(xì)胞倍增時間短;早期容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;一線化療敏感性高等特性。然而近30年小細(xì)胞肺癌治療療效幾乎停步不前，5年生存率不到5％。目前SCLC主要治療措施為全身化療或聯(lián)合局部放療，一線化療有效率達(dá)60-80％，而化療后極易耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移;二線治

3、療目前缺乏有效的治療手段。目前研究發(fā)現(xiàn)SCLC存在大量體細(xì)胞突變及異質(zhì)性，盡管關(guān)于小細(xì)胞肺癌的臨床試驗進(jìn)行了很多，但是最后證明有效的卻很少，迄今尚未發(fā)現(xiàn)有效的分子治療靶點。SCLC一致以來就是臨床研究中的一項難題，迫切需要新的有效治療手段。較為熱門的研究主要集中在改善化療耐藥以及新的治療手段（如免疫治療、生物導(dǎo)彈治療等）研發(fā)。
　　細(xì)胞凋亡由多基因調(diào)控的細(xì)胞程序化死亡方式，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定;在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。凋亡

4、抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Proteins，IAPs)是一族主要凋亡抑制因子，包括8種蛋白因子。Survivin基因即是IAPs中一名重要的家庭成員，在組織細(xì)胞的分布上具有鮮明的特點，主要表現(xiàn)為細(xì)胞分布上的選擇性，即除了胸腺和生殖腺組織細(xì)胞外在成年人其他分化組織細(xì)胞中皆未表達(dá)，主要表達(dá)在大部分的惡性腫瘤細(xì)胞組織中。其主要功能為:促進(jìn)細(xì)胞的生長增值，抑制細(xì)胞凋亡。近幾年研究發(fā)現(xiàn)Survivin基因與腫瘤細(xì)胞對

5、化療產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān)，可能為腫瘤化療耐藥的機制之一。
　　近年來Survivin基因在肺癌方面的研究逐漸增多。NSCLC患者Survivin蛋白在腫瘤組織中高表達(dá)，與臨床分期較晚、無病生存期短及總生存時間短密切相關(guān)，可能作為一種NSCLC患者診斷敏感指標(biāo)和治療靶點。但目前大部分試驗主要集中在NSCLC，對于SCLC研究目前尚處于探索期。特別針對SCLC的前期化療敏感，極易耐藥導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特點，探索Survivin基因在小細(xì)胞肺

6、癌的發(fā)生發(fā)展的作用及逆轉(zhuǎn)化療耐藥，提供可行性及必要性，以便能找到有效的治療手段。
　　方法：
　　1、采用免疫組化方法（SP法），檢測120例SCLC癌組織和13例癌旁正常肺標(biāo)本中Survivin蛋白的表達(dá)情況，并結(jié)合患者基本臨床資料及隨訪結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。
　　2、利用脂質(zhì)體包裹Survivin基因序列特異性siRNA，轉(zhuǎn)染人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446，實驗分為3組:Survivin SiRNA轉(zhuǎn)染組(Si-S

7、ur組)，無意SiRNA轉(zhuǎn)染組（Si-NC組）和單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（正常對照組）。采用RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測Survivin mRNA及蛋白表達(dá);噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測腫瘤細(xì)胞在增值方面的具體情況;微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)（Transwell實驗）小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移能力。
　　3、體外實驗利用脂質(zhì)體包裹SurvivinSiRNA，轉(zhuǎn)染人小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株NCI-H446/VP，實驗分為3組:S

8、urvivin SiRNA轉(zhuǎn)染組(Si-Sur組)，無意SiRNA轉(zhuǎn)染組（Si-NC組）和單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（正常對照組）。觀察癌細(xì)胞的生物特性的變化;采用流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。Westernblot檢測細(xì)胞survivin蛋白、Bcl-2蛋白，Bax蛋白及Cleaved Caspase-3蛋白的含量與相關(guān)性，初步探索SURVIVIN逆轉(zhuǎn)耐藥機制。
　　結(jié)果：
　　1、Survivin蛋白在小細(xì)胞

9、肺患者中陽性表達(dá)率為62.5％(75/120)，而在正常13例肺組織中，有1例病灶旁正常肺組織的Survivin蛋白弱表達(dá)，所占比例為7.7％，兩組的差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。在混合型SCLC患者18中，有5例(27.8％)患者的Survivin蛋白弱表達(dá)，而在單純SCLC患者中，68.6％(70/102)患者的Survivin蛋白高表達(dá)，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。大約16.7％(2/12)小細(xì)胞肺癌局限期(

10、T1-2N0M0)期的患者中存在Survivin蛋白表達(dá)，且為弱表達(dá)。而其他局限期及廣泛期患者中Survivin蛋白表達(dá)比例分別為:58.5％(24/41)，73.1％(49/67)。表明Survivin蛋白在SCLC中隨著臨床分期的升高，其陽性率也逐漸增高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。在腦轉(zhuǎn)移的SCLC中，Survivin蛋白表達(dá)的比例大約91.5％，在無腦轉(zhuǎn)移的SCLC中陽性表達(dá)率只有20.4％，二者之間的差異明顯，具有統(tǒng)

11、計學(xué)意義。在SCLC中Survivin蛋白表達(dá)情況與性別、年齡及吸煙等無明顯相關(guān)性。癌組織Survivin蛋白表達(dá)是影響小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，高表達(dá)組與陰性表達(dá)組的中位生存時間比值為8月∶17月，無進(jìn)展生存期為4∶8月。
　　2、RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Si-Sur轉(zhuǎn)染組相對于對照組，NCI-H446細(xì)胞Survivin基因在mRNA及蛋白水平明顯下降。觀測NCI-H446細(xì)胞經(jīng)各組處理后在1周內(nèi)

12、的增殖情況;MTT實驗結(jié)果提示在Si-Sur脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖明顯受到抑制，而在Si-NC組與空白對照組中NCI-H446細(xì)胞的增殖速度無明顯差異，三組之間具有明顯差異，并具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時也觀察到Si-Sur脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NCI-H446細(xì)胞后體積、排列情況也發(fā)生明顯變化;Transwell小室結(jié)合結(jié)晶紫染色檢測細(xì)胞侵襲能力結(jié)果顯示:通過酶標(biāo)儀測量OD值，結(jié)果顯示Si-Sur組細(xì)胞OD值與對照組相比明顯降低，存在顯著性差異(F156.

13、350，P＜0.05)。而陰性對照組OD值與對照組的數(shù)值相比略為下降，并沒有表現(xiàn)出明顯的差異（P＞0.05）。在Si-Sur組腫瘤細(xì)胞侵襲能力受到明顯抑制。
　　3、NCI-H446/VP細(xì)胞在不同依托泊苷濃度中Si-Sur組細(xì)胞與Si-NC組以及空白對照組相比，存活率較低，存在著顯著的差異變化，具有統(tǒng)計學(xué)意義，而對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這表明SiRNASurvivin可以一定程度上逆轉(zhuǎn)NCI-H446/VP

14、細(xì)胞對依托泊苷的耐藥性。在Si-Sur轉(zhuǎn)染組中，對依托泊苷的耐藥指數(shù)是7.62，對照組中轉(zhuǎn)染Si-NC和NCI-H446/VP對依托泊苷的耐藥指數(shù)分別是11.17、11.39，三組之間具有明顯差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。為了解其逆轉(zhuǎn)耐藥作用機制，流式細(xì)胞儀分析檢測三組(SiSurvivin組、Si NC組及空白對照組)細(xì)胞凋亡水平分別為49.512±0.248;5.500±0.529;4.890±0.854。Western b

15、lot檢測實驗三組Survivn蛋白分別為0.032±0.012,0.081±0.007,0.123±0.004; Cleaved Caspase-3蛋白為1.374±0.015,0.240±0.016，0.232±0.033，Bax蛋白為0.334±0.015，0.077±0.005，0.046±0.005;Bcl-2蛋白為0.045±0.013，0.147±0.012，0.381±0.017，對三組的蛋白進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)三組之間的

16、數(shù)據(jù)具有顯著性的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)檢測結(jié)果可知對比正常細(xì)胞對照組、陰性對照組，Survivin蛋白在Si-Sur組條帶灰度值減弱，表明Survivin的表達(dá)出現(xiàn)了鮮明的下調(diào)現(xiàn)象，三組之間表現(xiàn)出了明顯的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示Si-Sur可抑制Survivin的蛋白表達(dá)。Western blot檢測各組Survivin蛋白、Cleaved Caspase3、BAX蛋白及Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)

17、果顯示在Si-Sur組Cleaved Caspase3蛋白及Bax蛋白顯著升高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下降。對比空白對照組、陰性對照組在SiSurvivin組中Cleaved Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.SCLC組織Survivin蛋白高表達(dá)，與患者臨床分期、腦轉(zhuǎn)移及化療療效密切相關(guān)，癌組織Survivin高表達(dá)的患者預(yù)后較差。
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