新抑癌基因NPRL2抑制人肺癌細(xì)胞生長和逆轉(zhuǎn)耐藥性作用的體外實驗研究.pdf

1、研究背景： 肺癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見疾病，目前國內(nèi)外肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。由于大多數(shù)肺癌患者臨床確診時已屬晚期，其中50％以上患者不能手術(shù)，而絕大部分肺癌患者(占肺癌的75％～80％，包括鱗癌、腺癌等)對現(xiàn)行放療和化療又不夠敏感，盡管已經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用手術(shù)、放療、化療、生物治療等各種手段，但其預(yù)后改善并不明顯，深入研究肺癌分子生物學(xué)特征對肺癌的早期診斷、治療及改善預(yù)后具有重要意義。因此肺癌的治療成為臨床治療一大

2、難題，目前基因治療和化療耐藥的研究已成為肺癌的熱門課題。 NPRL2是一種最新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，目前國外少數(shù)專家的研究發(fā)現(xiàn)：其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，特別是該基因的表達(dá)缺失導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥發(fā)生的特點(diǎn)，從而讓我們有理由相信：抑癌基因NPRL2的轉(zhuǎn)染與導(dǎo)入必將抑制腫瘤細(xì)胞增值、誘導(dǎo)凋亡及逆轉(zhuǎn)順鉑類的耐藥從而使NSCLC的治療可能進(jìn)入一個嶄新的境界。 我們率先對NPRL2基因進(jìn)行了臨床研究，利用免疫組化技術(shù)對我

3、國的非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)該基因在NSCLC的病理組織中和多種肺癌細(xì)胞株上具有較高的缺失率，從而給我們的下一步研究工作奠定了基礎(chǔ)。 本研究試圖利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)途徑，構(gòu)建NPRL2基因載體，建立穩(wěn)定高表達(dá)NPRL2蛋白的肺癌細(xì)胞株，利用質(zhì)粒構(gòu)建-成功轉(zhuǎn)染-穩(wěn)定培養(yǎng)的細(xì)胞株來研究轉(zhuǎn)染NPRL2基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生長抑制及其作用機(jī)制。我們將利用耐順鉑人肺腺癌細(xì)胞株(A549/CDDP)進(jìn)行體外的實驗研究：NPRL2

4、基因轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)A549/CDDP細(xì)胞株中NPRL2基因缺失表達(dá)，并能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡、逆轉(zhuǎn)順鉑類的耐藥，從而明顯抑制A549/CDDP細(xì)胞株的生長。為進(jìn)一步進(jìn)行肺癌基因治療的臨床前期研究提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 第一章 NPRL2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義 目的：檢測NPRL2蛋白在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)，探討其臨床意義。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測80例非小細(xì)胞肺癌組織及1

5、3例正常肺組織中NPRL2蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)和臨床病理以及術(shù)后隨訪資料的相關(guān)性。Cox多因素分析肺癌臨床病理特征指標(biāo)及NPRL2表達(dá)對NSCLC預(yù)后的影響。 結(jié)果：肺癌中NPRL2蛋白陽性表達(dá)35例(43.8％)，正常肺組織中陽性表達(dá)12例(92.35％)，兩者差異顯著(P<0.05)。肺鱗癌中陽性表達(dá)14例(33.33％)，肺腺癌中陽性表達(dá)21例(55.26％)，二者差異顯著(P<0.05)；NPRL2蛋白在Ⅰ期陽性表達(dá)率

6、為69.24％(9/13)；Ⅱ期為46.15％(18/39)，ⅢA期為45.32％(26/47)，NPRL2蛋白在非小細(xì)胞肺癌中隨著TNM分期的增加表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。NPRL2蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC(N1-2)中陽性表達(dá)率為27.28％(9/33)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC(N0)中陽性表達(dá)率為45.32％(26/47)，差異顯著(P＜0.05)。NPRL2蛋白表達(dá)缺失與年齡、性別、吸煙等因素?zé)o關(guān)。NPRL2蛋白陽性表

7、達(dá)組的病人無瘤生存時間顯著高于陰性組(p=0.026)。COX多因素分析結(jié)果顯示UICC分期、NPRL2表達(dá)和有無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移3個因素對生存率的影響有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：新抑癌基因NPRL2缺失在肺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中可能起重要作用；NPRL2可能成為預(yù)測肺癌預(yù)后的新的腫瘤標(biāo)志物。 第二章NPRL2基因轉(zhuǎn)染對肺癌A549/CDDP細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的影響 目的：探討NPRL2基因轉(zhuǎn)染對肺癌細(xì)胞株A549/CD

8、DP腫瘤生物學(xué)行為的影響。 方法：利用基因重組技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NPRL2，脂質(zhì)體life2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞株A549/CDDP，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)NPRL2的細(xì)胞株，MTT方法、劃痕愈合實驗和侵襲小室實驗檢測轉(zhuǎn)染前后A549/CDDP的腫瘤生物學(xué)行為。 結(jié)果：A549/CDDP細(xì)胞在轉(zhuǎn)染NPRL2基因后，克隆形成數(shù)減少，克隆體積較小，數(shù)目且排列較散，克隆形成率為12.6％；而轉(zhuǎn)染空

9、白質(zhì)粒組克隆形成數(shù)較多，克隆體積較大，數(shù)目且排列緊密，克隆形成率分別為19.5％，兩者差異有顯著性(P＜0.05)。表明NPRL2轉(zhuǎn)染A549/CDDP細(xì)胞后的增殖能力明顯低于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞；A549/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染NPRL2后遷移細(xì)胞數(shù)為14.09±4.23個，顯著低于pcDNA3.1組34.18±9.77個，A549/CDDP組36.14±8.50個(P<0.05)。表明NPRL2轉(zhuǎn)染A549/CDDP細(xì)胞后顯著降低其

10、遷移力；A549/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染NPRL2后穿透matrigel的細(xì)胞數(shù)為74.09±4.48個，顯著低于pcDNA3.1組124.18±6.43個，A549/CDDP組120.14±7.25個(P<0.05)。表明NPRL2轉(zhuǎn)染A549/CDDP細(xì)胞后顯著降低其侵襲力。 結(jié)論：抑癌基因NPRL2的轉(zhuǎn)染可以抑制A549/CDDP細(xì)胞的增殖和侵襲運(yùn)動。 第三章 NPRL2基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)A549/CDDP細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)其耐藥

11、性的研究 目的：探討新抑癌基因NPRL2在逆轉(zhuǎn)A549/CDDP耐藥性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制。 方法：用0、10、40、160、320umol/mL濃度梯度的CDDP處理穩(wěn)定表達(dá)NPRL2的A549/CDDP細(xì)胞后，MTT檢測細(xì)胞增殖、檢測A549細(xì)胞和A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的耐藥指數(shù)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化；激酶法檢測NPRL2轉(zhuǎn)染對A549/CDDP細(xì)胞Caspase-3活性的影響，細(xì)胞免疫組化檢測Bl

12、c-2、Bax、P53和LRP蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：pcDNA3.1-NPRL2組細(xì)胞死亡率隨順鉑濃度的增加而顯著增加與pcDNA3.1組、A549/CDDP組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而pcDNA3.1組、A549/CDDP組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示NPRL2的轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)的A549/CDDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。pcDNA3.1-NPRL2轉(zhuǎn)染組對順鉑的半數(shù)抑制濃度IC50為156.91±3.02/μ

13、mol/L，對順鉑的耐藥指數(shù)為7.62。對照組中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和A549/CDDP對順鉑的半數(shù)抑制濃度IC50為226.53±2.31和226.71±0.01/μmol/L，對順鉑的耐藥指數(shù)為11.17和11.39，比較差異有顯著性(P<0.05)。提示NPRL2轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)A549/CDDP細(xì)胞的耐藥性。且pcDNA3.1-NPRL2對肺腺癌A549/CDDP細(xì)胞存活率的抑制呈現(xiàn)出時間依賴性，與對照組比較差異有顯著性(P<0.0

14、5)；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NPRL2基因后A549/CDDP細(xì)胞生長緩慢，G0-G1期增多，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；pcDNA3.1-NPRL2轉(zhuǎn)染組在不同時間點(diǎn)均可使得A549/CDDP細(xì)胞Caspase-3活性增高，以48h最為顯著，其相對活性為1.1298±0.2502，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；NPRL2高表達(dá)明顯下調(diào)LRP蛋白和bcl-2蛋白，上調(diào)bax蛋白表達(dá)，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)