Etk基因調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡及腫瘤化療的抗藥性研究.pdf

1、據(jù)全球癌癥發(fā)病的最新統(tǒng)計資料顯示肺癌為當(dāng)今世界第一高發(fā)癌，在發(fā)展中國家，中國男性肺癌屬高發(fā)人群，而女性肺癌與澳洲、新西蘭一樣，屬于世界范圍內(nèi)中等發(fā)病率的人群。近年來肺癌在我國發(fā)病率呈明顯上升趨勢。小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）發(fā)病率占原發(fā)性肺癌的10%～25%，腫瘤的分化程度很低，較早發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。雖然SCLC對化療敏感，但很快即可發(fā)生多藥耐藥（multidrug resistance，M

2、DR）現(xiàn)象而導(dǎo)致化療失敗。MDR指腫瘤一旦對某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，就同時對其他結(jié)構(gòu)上無關(guān)、作用機(jī)理各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，是一種特殊的廣譜耐藥現(xiàn)象。小細(xì)胞肺癌患者對目前臨床應(yīng)用的化療藥物反應(yīng)敏感，但由于極易出現(xiàn)耐藥性，化療效果常常不理想，以致小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)率很高，臨床預(yù)后差，一般2年存活率不足5%，90%的患者多在確診后5年內(nèi)死亡。因此，化療抗藥性已成為近年來小細(xì)胞肺癌臨床治療急需解決的問題之一。 盡管Bcl-2家族凋亡相

3、關(guān)基因在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用機(jī)制研究已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但其上游基因的調(diào)控通路尚不清楚，已有研究表明酪氨酸激酶在細(xì)胞凋亡的調(diào)控通路中可能起到重要作用。 酪氨酸激酶分為受體類和非受體類兩大類，Btk家族是近年來研究較多的與T、B淋巴細(xì)胞增殖分化關(guān)系密切的一大類非受體類酪氨酸激酶。上皮和內(nèi)皮細(xì)胞酪氨酸激酶（epithelial and endothelial tyrosine kinase，Etk），又名骨髓X激酶（bone marr

4、ow X kinase，Bmx），是Btk家族（Btk/AKT，ITK/EMT/TSK，Txk，TEC及Etk/BMX）中的重要成員之一。Etk激酶是Btk家族中唯一除分布于淋巴造血細(xì)胞外，還在上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的非受體類酪氨酸激酶。盡管Etk在上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平不高，但研究發(fā)現(xiàn)它在上皮增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生過程中起著重要調(diào)控作用：Qiu證實Etk參與了IL-6介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞的分化。Guo等通過免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)E

5、tk有可能在部分病例中參與了鼻咽黏膜上皮分化的調(diào)節(jié)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶Etk在小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于肺鱗癌和肺腺癌，Etk表達(dá)與凋亡相關(guān)基因Bcl-2等有明顯相關(guān)性，為進(jìn)一步探討Etk與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，我們用阿霉素處理小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞和Etk高表達(dá)細(xì)胞株NCI-H446 WT兩種細(xì)胞，結(jié)果表明Etk對阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抵抗作用。 基于酪氨酸激酶Etk在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的

6、作用，本實驗通過細(xì)胞和分子生物學(xué)實驗，進(jìn)一步研究Etk在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株中表達(dá)情況及與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族之間的關(guān)系，探討Etk在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生中的作用，為臨床解決小細(xì)胞肺癌治療中極易出現(xiàn)的耐藥性問題提供新的理論依據(jù)。 目的： 1本實驗選擇小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69與其阿霉素耐藥細(xì)胞株H69AR作為研究對象，分析兩株細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期和對化療藥物敏感性的差異。 2.分析小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H6

7、9與其阿霉素耐藥細(xì)胞株H69AR在mRNA和蛋白水平二者Etk表達(dá)的差異，運用RNAi技術(shù)將高表達(dá)Etk的H69AR細(xì)胞株中的Etk進(jìn)行沉默后，檢測沉默效果，觀察H69AR細(xì)胞株耐藥性的變化。 3.分析小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69與其阿霉素耐藥細(xì)胞株H69AR兩細(xì)胞株中Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、 Bak及Bax）表達(dá)的差異以及Etk蛋白與Bcl-2家族蛋白表達(dá)的關(guān)系。 方法： 1.光學(xué)顯微鏡下觀察小

8、細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69與其阿霉素耐藥細(xì)胞株H69AR二者形態(tài)學(xué)及細(xì)胞周期的差異。 2.應(yīng)用CCK8法檢測小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69與其阿霉素耐藥細(xì)胞株H69AR二者耐藥指數(shù)的差異，驗證H69AR對阿霉素耐藥性和其他化療藥物的交叉耐藥性； 3.實時定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot技術(shù)分析兩細(xì)胞株中Etk和磷酸化Etk（P-Etk）表達(dá)的差異； 4.經(jīng)實時定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot技術(shù)

9、證實H69AR細(xì)胞中Etk表達(dá)水平明顯高于H69細(xì)胞后，運用脂質(zhì)體Lipofectamine2000法將EtksiRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入H69AR細(xì)胞，進(jìn)行Etk基因沉默，運用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot技術(shù)檢測基因沉默效果； 5.CCK8法檢測Etk：沉默后的H69AR細(xì)胞耐藥性的變化； 6.流式細(xì)胞術(shù)及Western blot技術(shù)檢測小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69和耐藥細(xì)胞株H69AR中Bcl-2、Bcl-xL、Bak及Ba

10、x蛋白表達(dá)的變化； 7.免疫共沉淀（IP）技術(shù)檢測Bcl-2家族中Bcl-xL蛋白與Etk蛋白的關(guān)系； 8.統(tǒng)計學(xué)分析：統(tǒng)計分析軟件為SPSS13.0版。細(xì)胞周期分析、蛋白含量測定、灰度值分析結(jié)果均重復(fù)三次（n=3），數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，具體統(tǒng)計方法采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05有顯著性差異。蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和細(xì)胞生存率曲線均由Excel作圖得到。 結(jié)果: 1

11、.相對于親代H69細(xì)胞，H69AR細(xì)胞的生長速度減慢，細(xì)胞周期分布G0/G1增加，由51.07±1.69增加至68.24±1.74（%），G2/M減少，由17.4±1.08減少至2.98±1.1，有顯著性差異（P<0.05）。 2.CCK8法耐藥譜分析顯示該H69AR細(xì)胞株對阿霉素的耐藥倍數(shù)為63.88，此外，該細(xì)胞系對其它化療藥物如紫三醇也有交叉耐藥，耐藥系數(shù)為5.626； 3.相對于親代H69細(xì)胞，經(jīng)實時定量PCR檢

12、測，在mRNA水平H69AR細(xì)胞中Etk水平顯著增高，由8.426×10-6增加至5.514×10-5；在蛋白水平H69AR細(xì)胞中Etk水平也顯著增高：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Etk蛋白由46±4.4增加至92.83±2.8，Western blot灰度值分析結(jié)果顯示Etk蛋白由0.56±0.014增加至0.99±0.038，有顯著性差異（p<0.05）； 4.通過基因沉默技術(shù)成功地降低H69AR細(xì)胞株中Etk含量，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)及We

13、stern blot檢測顯示Etk沉默后的H69AR細(xì)胞中Etk水平明顯降低，流式結(jié)果顯示Etk水平由77.7±2.9降至6.9±1.8，Western blot灰度值顯示Etk水平由0.4457±0.005降至0.2925±0.0038，有顯著性差異（p<0.05）； 5.CCK8結(jié)果顯示，Etk沉默后的H69AR細(xì)胞對阿霉素的耐藥性明顯降低，耐藥指數(shù)由63.88降至7.26； 6.相對于親代H69細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

14、顯示，H69AR細(xì)胞中Bcl-2（由86.6±0.83增加至93.3±1.93）和Bcl-xL（由28.1±1.32增加至45.7±1.4）表達(dá)顯著增高，而Bak（由28.6±0.96降低至9.7±0.42）和Bax（由19.8±0.78降低至9.7±0.42）的表達(dá)水平顯著降低，有顯著性差異（P<0.05）；Western blot灰度值結(jié)果顯示，H69AR細(xì)胞中Bcl-2（由0.736±0.02增加至0.907）和Bcl-xL（由0

15、.571±0.007增加至0.714±0.009）表達(dá)顯著增高，而Bak（由0.427±0.005降低至0.264±0.009）和Bax（由0.306±0.009降低至0.214±0.007）表達(dá)水平顯著降低，有顯著性差異（P<0.05）； 7.根據(jù)IP結(jié)果顯示，Etk蛋白和Bcl-2中Bcl-xL蛋白是相互作用的蛋白質(zhì)，并且進(jìn)一步驗證了相對于親代H69細(xì)胞，H69AR細(xì)胞中Bcl-xL蛋白和Etk蛋白顯著增高。 結(jié)論：

16、 1.人小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株H69AR具有多藥耐藥性； 2.相對于小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69，小細(xì)胞肺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株H69AR中Etk水平顯著增高，基因沉默技術(shù)降低H69AR中Etk水平后，H69AR對阿霉素的敏感性顯著增加，進(jìn)一步證實了Etk有抵抗化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并且在小細(xì)胞肺癌耐藥性產(chǎn)生過程中可能起到重要的作用； 3.人小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株H69AR耐藥性的產(chǎn)生可能與Etk水平增高、Bcl-2家族