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文檔簡介
1、猝死是法醫(yī)司法鑒定中最常見也是最復(fù)雜的問題之一。一般地,成人猝死多是心源性猝死。心源性猝死一般是由于多種心臟疾病導(dǎo)致的急速發(fā)生的、出人意料的自然死亡。臨床上導(dǎo)致心源性猝死的原因較多,如冠狀動脈狹窄導(dǎo)致心臟急性的缺血、缺氧;應(yīng)激情況下兒茶酚氨的釋放增加致使心室電生理紊亂,引起暫時嚴(yán)重心律失常如室顫,導(dǎo)致心源性猝死。另外,心肌的炎癥、纖維化以及心室結(jié)構(gòu)的改變,均可以成為心源性猝死的基礎(chǔ)。目前臨床中心源性猝死的患者多有心臟病史,最常見的就是冠
2、心病引起的急性心肌缺血缺氧。早期心肌缺血缺氧所致猝死心肌的變化,在法醫(yī)病理鑒定中十分困難,有待探尋標(biāo)記物在分子水平上進(jìn)行鑒別診斷。近來的研究表明,心臟中存在著心肌干細(xì)胞,缺氧誘導(dǎo)因子在調(diào)節(jié)心肌干細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用,可使心肌再生,使受損的心肌修復(fù),進(jìn)而改善心臟的功能。microRNA是長21-26個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,結(jié)構(gòu)一般高度保守。microRNA通過特異性的結(jié)合靶基因mRNA的3'-UTR相應(yīng)基因序列,進(jìn)而抑制
3、靶基因的翻譯過程或直接促進(jìn)下游mRNA的降解,調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá),是基因表觀調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能的重要途徑?,F(xiàn)已證實 miRNA的調(diào)控功能復(fù)雜而且廣泛,涉及人體約60%的蛋白表達(dá)和近乎所有細(xì)胞的生物學(xué)功能,包括組織血管生成,新陳代謝,細(xì)胞生長分化、增殖、凋亡、癌變等所有生物過程。microRNAs作為多個靶點的上游調(diào)控因子,調(diào)控受損心肌修復(fù)及心肌干細(xì)胞的增殖而受到越來越多的關(guān)注。有報道,正常細(xì)胞中存在miR-138,但miR-138與缺氧
4、誘導(dǎo)因子在心肌組織中作用的關(guān)系尚不清楚。Sca-1認(rèn)為是心肌干細(xì)胞標(biāo)記物。
本研究通過對選取人心肌梗死尸檢案例和大鼠心肌細(xì)胞系 H9C2,并選用miR-138、缺氧誘導(dǎo)因子1 alpha(Hypoxia-inducible factor1 alpha,HIF-1α)及結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF),Notch1、Sca-1觀察其在不同時期心肌梗死時間點的表達(dá)變化,通
5、過重組腺病毒上調(diào)與下調(diào)miR-138的表達(dá)對 HIF-α﹑Sca-1﹑Notch1、CTGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響及對心肌梗死修復(fù)與心肌干細(xì)胞的增殖調(diào)控作用,探討 miR-138及 HIF-1α在缺氧梗死心肌組織細(xì)胞中的作用機制,同時尋找早期因缺血缺氧致猝死的的法醫(yī)病理鑒定的方法和標(biāo)記物。
第一部分 miR-138與HIF-1α在人心肌梗死組織中的表達(dá)意義及相關(guān)性分析
目的:
探討不同時期的心肌梗死組織中
6、miR-138與 HIF-1α及其相關(guān)分子表達(dá)特點和心肌干細(xì)胞的增殖情況及其意義。
方法:
1.提取人心肌組織中的microRNA,利用RT-PCR檢測各組心肌梗死組織中miR-138的表達(dá)情況,同時檢測不同時段心肌梗死組織中HIF-α在基因水平的表達(dá)情況。2.采用免疫組織化學(xué)的方法,檢測各組心肌細(xì)胞中HIF-α、CTGF、Notch1以及Sca-1的表達(dá)。3.運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對miR-138、HIF-1
7、α、CTGF、Notch1和Sca-1表達(dá)情況進(jìn)行比較和分析,探討其相關(guān)性。
結(jié)果:
1. miR-138在心肌組織中均有表達(dá),miR-138在正常心肌組織中表達(dá)較低,在心肌梗死組中表達(dá)明顯升高,在晚期心肌梗死組中的表達(dá)高于早期心肌梗死組。HIF-1α mRNA在早期心肌梗死組中表達(dá)高于正常心肌組與晚期心肌梗死組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2. HIF-1α、Notch1以及Sca-1蛋白在正常心肌組織及晚
8、期心肌梗死組中表達(dá)較低,呈弱陰性;HIF-1α、Notch1以及 Sca-1在早期缺氧心肌梗死組中表達(dá)明顯呈上升的趨勢,高于正常心肌及晚期缺氧心肌梗死組,組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3. CTGF在晚期心肌梗死組中表達(dá)明顯高于正常心肌與早期心肌梗死組,組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:
miR-138與HIF-1α表達(dá)呈負(fù)相關(guān),HIF-1α與Sca-1的表達(dá)呈正相關(guān),提示miR-138可能抑
9、制HIF-α的表達(dá),通過抑制HIF-α/Notch1信號通路抑制干細(xì)胞的增殖。HIF-1α和Sca-1可作為早期缺氧致心肌梗死標(biāo)記物的參考。晚期缺氧心肌梗死組織中 CTGF的表達(dá)顯著增多,提示 miRNA-138與心肌修復(fù)的纖維化有關(guān)。
第二部分構(gòu)建攜帶大鼠 miR-138基因及慢病毒載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞H9C2的研究
目的:
分別構(gòu)建miR-138真核質(zhì)粒表達(dá)載體,通過鑒定,然后再構(gòu)建miR-138
10、慢病毒載體,最后再將載體轉(zhuǎn)染至H9C2大鼠心肌細(xì)胞中,為研究缺氧引起的心肌梗死的生物學(xué)機制,提供有效的細(xì)胞模型及實驗平臺。
方法:
1.常規(guī)培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞,基因檢測miR-138的基因表達(dá),應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增miR-138,然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和預(yù)先設(shè)計好的載體 pEGFP-N1連接,從而構(gòu)建完整的pEGFP-miR-138載體,經(jīng)過酶切、測序證實之后采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染
11、試劑盒將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中。
2.構(gòu)建 Lenti-138-EX慢病毒表達(dá)載體,并包裝、純化慢病毒,經(jīng)鑒定慢病毒包裝成功后將其感染大鼠心肌細(xì)胞,提取總RNA,在基因水平檢測miR-138在大鼠心肌細(xì)胞H9C2中的表達(dá)變化。
結(jié)果:
從H9C2細(xì)胞基因組中成功擴(kuò)增出含有miR-138基因的目的片段,并將其連接到載體pEGFP-N1,命名為pEGFP-miR-138,且轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞效果較好。成功包
12、裝了能夠表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體,命名為Lenti-miR-138。
結(jié)論:
成功構(gòu)建了miR-138真核質(zhì)粒表達(dá)載體和慢病毒載體,并獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞,為深入研究miR-138在心肌缺氧及梗死調(diào)控機制提供了有效的工具和平臺。
第三部分miR-138與HIF-1α靶向關(guān)系的研究
目的:
驗證HIF-1α是miR-138的下游靶向調(diào)節(jié)基因。
方法:
利用生物
13、信息學(xué)軟件 Target Scan(www.targetScan.org)軟件預(yù)測miR-138的下游調(diào)節(jié)基因。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-138與靶基因HIF-1α3'-UTR序列的相互作用關(guān)系。
結(jié)果:
通過Target Scan系統(tǒng)檢測,miR-138與靶基因HIF-1α3'-UTR序列存在靶向調(diào)節(jié)序列。進(jìn)一步采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),miR-138與靶基因HIF-1α3'-UTR序列
14、具有相互作用,miR-138可以在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平上調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)。
結(jié)論:
miR-138可以靶向調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá),HIF-1α是miR-138的下游靶基因。
第四部分 miR-138通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)在心肌缺氧梗死后心肌重構(gòu)的分子機制研究
目的:
觀察缺氧時大鼠心肌細(xì)胞H9C2 miR-138與HIF-1α表達(dá)變化與纖維蛋白、心肌干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的關(guān)系。
15、方法:
采用體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)的方法,通過轉(zhuǎn)染miR-138 mimics或miR-138 inhibitors或基因干擾,分別上調(diào)或下調(diào)H9C2細(xì)胞中miR-138的表達(dá)、上調(diào)H9C2細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)。經(jīng)氯化鈷處理后,流式細(xì)胞儀檢測不同組別細(xì)胞凋亡比例,以及通過實時定量PCR與Western blot方法,分別檢測心肌細(xì)胞中HIF-1α、Bcl-2、Sca-1、Notch1及CTGF的表達(dá)變化。
結(jié)果:
16、 利用二氯化鈷成功構(gòu)建大鼠心肌缺氧模型;上調(diào) miR-138表達(dá),可以促進(jìn)缺氧條件下心肌細(xì)胞的凋亡,下調(diào)miR-138表達(dá)或者上調(diào)HIF-1α的表達(dá),可以抑制心肌細(xì)胞在缺氧條件下的凋亡。上調(diào)HIF-1α的表達(dá),可以促進(jìn)心肌干細(xì)胞標(biāo)記物Sca-1和Notch1的表達(dá),抑制CTGF的表達(dá)。
結(jié)論:
miR-138可以調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá),HIF-1α在低氧環(huán)境條件下可以通過Notch1信號通路促進(jìn)心肌干細(xì)胞的增殖,m
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