胰島素信號通路負性調(diào)節(jié)因子Lnk對正常卵巢上皮和上皮性卵巢腫瘤細胞的增殖調(diào)節(jié)及其機制研究.pdf

1、第一章 Lnk對胰島素/IGF-I信號通路的調(diào)節(jié)
　　 目的：研究Lnk對胰島素或IGF1細胞信號通路的影響及其作用機制。
　　 方法：(1)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Lnk WT(或和Lnk RE)質(zhì)粒的TOV112D和OVCA420細胞株。(2)Western blot檢測100ng/ml人重組IGF1或100 nM人重組胰島素處理前和處理15分鐘后的磷酸化和總AKT、ERK和4EBP1信號通路蛋白。(3)

2、免疫共沉淀(CoIP)檢測體外Lnk和IR是否結(jié)合。
　　 結(jié)果：(1)LnkWT抑制的TOV112D和OVCA420中無Ins處理或Ins反應的P13K-AKT和MAPK-ERK信號通路。(2) Lnk下調(diào)IGF1反應的MAPK-ERK但卻上調(diào)PI3K-AKT信號傳導，所有狀態(tài)的AKT、4EBP1和ERK總蛋白則沒有明顯變化。(3) Lnk和IR的結(jié)合實驗顯示，Lnk與IR在體外可以結(jié)合，但是程度中等。
　　 結(jié)論：(

3、1) Lnk可以抑制上皮性卵巢腫瘤細胞中PI3K-AKT和MAPK-ERK細胞信號傳導。(2)Lnk可以負性調(diào)節(jié)胰島素反應的PI3K-AKT和MAPK-ERK細胞信號傳導，作為胰島素信號通路的一個新抑制因子，可能在上皮性卵巢腫瘤以及其他胰島素信號通路異常相關性疾病中起作用。(3)Lnk上調(diào)IGF1反應的PI3K-AKT通路而下調(diào)MAPK-ERK細胞信號，Lnk對上皮性卵巢腫瘤細胞中IGF1反應的PI3K與ERK1/2通路可能存在相互作用

4、，Lnk對胰島素和IGF1分別反應的細胞信號通路的作用存在差異。(4)Lnk與IR在體外中等結(jié)合。
　　 第二章 Lnk在正常卵巢和卵巢腫瘤中的表達，以及對其增殖的影響和機制探討
　　 目的：檢測Lnk在正常卵巢和上皮性卵巢腫瘤組織，以及人正常卵巢上皮和卵巢上皮性腫瘤細胞株中的表達；并研究Lnk對正常卵巢上皮和上皮性卵巢腫瘤細胞增殖的影響及其作用機制。
　　 方法：(1)上皮性卵巢腫瘤和正常卵巢組織的石蠟切片標本

5、各5例，免疫組化方法檢測各標本中Lnk蛋白的表達。(2)采用real-time PCR法檢測多個上皮性卵巢腫瘤以及正常卵巢上皮細胞株中Lnk mRNA的表達。(3) SRB法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LnkWT和/或LnkRE，EV的TOV112D、OVCA420和IOSE144細胞的增殖曲線。(4)雙層軟瓊脂克隆形成試驗檢測轉(zhuǎn)染了LNK質(zhì)粒的上述細胞的克隆形成能力。
　　 結(jié)果：(1)正常卵巢外皮質(zhì)的各期卵泡中皆見Lnk蛋白的表達。在卵巢上

6、皮性腫瘤中腫瘤組織和間質(zhì)均有的很強的Lnk表達，較正常卵巢明顯增多。(2)Lnk在各個細胞株中均有表達。卵巢上皮性腫瘤細胞株與人白血病細胞株中的表達無明顯差異。正常卵巢上皮細胞株IOSE144和IOSE80的表達較K-562稍低。(3)SRB生長曲線和軟瓊脂克隆形成試驗皆顯示LnkWT抑制TOV112D、OVCA420和IOSE144細胞增殖，LnkRE與EV比較則無統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論：(1)Lnk在正常卵巢上皮中有較高表

7、達，并可抑制正常卵巢上皮細胞的增值，提示Lnk可能參與在正常卵巢上皮增殖的調(diào)節(jié)。
　　 (2) Lnk在上皮性卵巢腫瘤中的表達較正常卵巢升高，可抑制上皮性卵巢腫瘤細胞的增殖，其作用部位在SH2區(qū)域，提示Lnk可能在上皮性卵巢的形成發(fā)展中起作用。
　　 第三章 LNK基因敲除小鼠和野生型小鼠卵巢的組織學比較
　　 目的：比較Lnk基因敲除(Lnk-/-)小鼠與Lnk野生型(Lnk WT)小鼠的卵巢組織學變化，在體內(nèi)

8、實驗進一步觀察Lnk對卵巢發(fā)育的影響。
　　 方法：收集6-8周大的野生型Lnk的C57B L/6小鼠和Lnk-/-129/Sv小鼠的雙側(cè)卵巢各3例，常規(guī)組織切片染色，觀察其組織學變化。
　　 結(jié)果：Lnk-/-與LnkWT小鼠的閉鎖的卵泡明顯減少。卵巢黃體中，Lnk-/-小鼠的血管較LnkWT小鼠的明顯增多，充血，細胞稍腫脹。
　　 結(jié)論：提示Lnk可促進卵泡閉鎖，對卵泡的發(fā)育及卵巢激素的分泌可能有影響。

9、>　　 本研究主要結(jié)論
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)Lnk可以負性調(diào)節(jié)上皮性卵巢腫瘤細胞中胰島素反應的PI3K-AKT和MAPK-ERK細胞信號傳導。
　　 2.發(fā)現(xiàn)Lnk可以下調(diào)上皮性卵巢腫瘤細胞中IGF1反應的MAPK-ERK，但卻上調(diào)PI3K-AKT細胞信號通路，提示Lnk對IGF1反應的PI3K與ERK1/2通路可能存在相互作用；Lnk對胰島素和IGF1分別反應的細胞信號通路的作用存在差異。
　　 3.首次發(fā)現(xiàn)L

10、nk在人類正常卵巢中有較高表達，并可抑制正常卵巢上皮細胞的增殖，而且Lnk-/-小鼠中凋亡卵泡減少，卵巢黃體中血管增多，充血明顯，提示Lnk可能參與在正常卵巢上皮增殖和卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)，對及卵巢激素的分泌也可能有影響。
　　 4.首次發(fā)現(xiàn)Lnk在上皮性卵巢腫瘤中的表達較正常卵巢明顯升高；而且Lnk可抑制上皮性卵巢腫瘤細胞中P13K-AKT和MAPK-ERK的信號傳導通路以及細胞增殖，提示Lnk可能通過影響細胞信號通路，在上皮性卵巢