鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對小鼠卵泡卵母細胞發(fā)育的影響及調(diào)控機制的研究.pdf

1、Calcineurin（鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶）是一種重要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，由催化亞基A和調(diào)節(jié)亞基B組成，A亞基分為α、β和γ亞型，B亞基分為1和2型。它們廣泛的分布于動物的各種組織和器官中，在細胞的信號傳遞過程中直接受Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)的調(diào)控，主要通過發(fā)揮去磷酸化的作用參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的許多重要過程，如細胞周期、細胞的生長及分化等。然而calcineurin在小鼠卵母細胞和顆粒細胞發(fā)育的過程中的作用及調(diào)控機制相關(guān)的報道較少。

2、　　本研究通過體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞、顆粒細胞、卵丘卵細胞復(fù)合體以及卵泡等，并利用calcineurin抑制劑FK506、腹腔灌胃、immunohistochemistry(IHC)、immunofluorescence(IF)、western blot(WB)、real time PCR、ELISA及流式細胞儀檢測等方法，揭示calcineurin在小鼠雌雄生殖系統(tǒng)中的表達模式及對卵巢卵泡、顆粒細胞和卵母細胞中的作用，進而獲得calci

3、neurin在小鼠卵母細胞中的作用及調(diào)控機制。
　　Calcineurin的定位表達結(jié)果顯示，calcineurin主要定位于在雌鼠卵巢卵泡及黃體細胞、輸卵管粘膜上皮和子宮肌層，并且在原始卵泡、初級卵泡、有腔卵泡以及排卵前的有腔卵泡中均有表達;在雄鼠睪丸和附睪頭、附睪體和附睪尾中都有陽性著色反應(yīng)，主要定位于睪丸間質(zhì)細胞和附睪頭、體和尾的精子和假復(fù)單層柱狀上皮細胞中。而calcineurin各個亞基亞型在卵母細胞和顆粒細胞中的表達模

4、式是:calcineurin A亞基的三個亞型（α、β和γ）在卵母細胞和顆粒細胞中都有表達，calcineurin Aβ的mRNA水平顯著高于α和γ亞型，calcineurin Aβ的mRNA水平在卵母細胞發(fā)生生發(fā)泡破裂(GVBD)時發(fā)生顯著的下降;calcineurin B亞基的兩個亞型（1和2）在顆粒細胞中均有表達，但B1型的mRNA水平顯著高于B2型，在卵母細胞則僅檢測到B1型mRNA的表達，并且在GV、GVBD及MⅡ期卵母細胞中

5、的表達水平?jīng)]有顯著性差異，呈現(xiàn)穩(wěn)定表達。進一步研究calcineurin A在卵細胞和顆粒細胞中的定位發(fā)現(xiàn):calcineurin A亞基定位于GV期卵母細胞的生發(fā)泡中，當卵母細胞發(fā)生GVBD時擴散到細胞質(zhì)中，并且GVBD期卵母細胞中calcineurin A亞基的蛋白水平顯著低于GV和MⅡ期卵母細胞，calcineurinA亞基在顆粒細胞中主要定位于細胞核中。
　　利用Calcineurin的抑制劑FK506對小鼠裸卵(DOs)

6、、卵丘卵母細胞復(fù)合體(COCs)、卵泡(FOs)及顆粒細胞、黃體細胞的培養(yǎng)結(jié)果顯示，calcineurin抑制劑FK506可以促進DOs、COCs以及FOs中卵母細胞發(fā)生GVBD，但不影響COCs卵丘的擴展。Calcineurin抑制劑FK506可以促進卵母細胞MPF以及顆粒細胞中MAPK的磷酸化，并且在低濃度組和高濃度可以抑制顆粒細胞的增殖，但是只有高濃度組可以促進顆粒細胞的凋亡。此外，F(xiàn)K506可以抑制黃體細胞孕酮的分泌，利用FK5