蛋白磷酸酶5(PP5)對小鼠脂肪代謝及骨發(fā)育的影響.pdf

1、蛋白磷酸酶5（protein phosphatase5，PP5）是一種廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，在細胞生長、增殖、分化、遷移以及脅迫條件下細胞的生存等多個方面發(fā)揮著重要作用。實驗中發(fā)現(xiàn) PP5基因敲除小鼠的體重較野生型輕，體型也較小。進一步以PP5基因敲除小鼠（PP5KO）為模型，較為深入地研究了PP5在脂肪代謝和骨發(fā)育中的作用。首先對高脂飼養(yǎng)WT和PP5 KO小鼠體重進行了動態(tài)檢測，MRI檢測小鼠體內(nèi)脂肪的分布，HE和油紅O染色

2、對小鼠肝臟組織進行病理學(xué)和組織化學(xué)分析，利用體外誘導(dǎo)WT和KO小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast cells，MEF）脂肪分化，利用western blotting和realtime-PCR研究了PP5基因?qū)χ痉只爸x相關(guān)通路基因的調(diào)控。同時為探究PP5在骨分化方面的作用，首先對WT和KO小鼠的體重及股骨長度進行測量分析；利用HE染色、CT掃描分別對WT和KO小鼠股骨組織結(jié)構(gòu)進行比較分析；利用

3、生物力學(xué)儀檢測了WT和KO小鼠股骨應(yīng)力的差異；利用體外誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stemcells，MSC）成骨分化、利用siRNA干擾前成骨細胞系MC3T3-E1 PP5基因的表達，研究PP5對骨分化的影響；利用western blotting、realtime-PCR和免疫組化技術(shù)研究了PP5基因?qū)前l(fā)育調(diào)控通路相關(guān)基因的調(diào)控。主要結(jié)果如下：
　　1.與WT對照小鼠相比，高脂飼喂的PP5 KO小鼠體重顯

4、著減輕且體重增加顯著變慢；肝臟中脂滴數(shù)量顯著減少，且脂滴較??；CT掃描顯示PP5 KO小鼠體內(nèi)脂肪積累顯著少于WT對照組。
　　2.通過體外誘導(dǎo)MEF細胞脂肪分化，發(fā)現(xiàn)與WT MEF細胞相比，PP5 KO MEF細胞脂肪分化明顯減弱，同時形成的脂滴較小。
　　3.real time PCR檢測PP5 KO小鼠肝臟組織中脂肪分化標記基因：脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid importer cluster of differe

5、ntiation36，CD36）、AP2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferator activated receptorγ2，PPARγ2）、葡萄糖轉(zhuǎn)運子4（glucose transporter4，GULT4）的相對表達量與WT小鼠相比顯著降低；western blotting的結(jié)果表明PP5 KO小鼠肝臟組織中磷酸化糖皮質(zhì)激素受體（phosphorylation glucocorticoid r

6、eceptor，p-GR）和解耦聯(lián)蛋白1（uncoupling protein1，UCP1）蛋白表達量顯著高于WT小鼠。
　　4.在骨發(fā)育方面，與WT小鼠相比，PP5 KO小鼠體重顯著減輕、股骨變短、變粗，骨小梁數(shù)量增加、骨小梁分離度變小、骨小梁厚度變大，相對骨體積（股骨中骨成分的體積/股骨的總體積）增大、骨密度顯著增大，皮質(zhì)骨厚度增加，骨相對表面積（股骨中骨成分的表面積/骨體積）減少，利用生物力學(xué)儀檢測發(fā)現(xiàn)PP5 KO小鼠股骨最

7、大載荷顯著減小，說明PP5基因敲除后小鼠骨分化增強但是股骨承重能力顯著減弱。
　　5.體外誘導(dǎo)骨分化實驗表明，與WT骨髓間充質(zhì)干細胞相比，PP5 KO間充質(zhì)干細胞體外骨分化顯著增加。
　　6. real time PCR結(jié)果顯示，PP5 KO小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞及軟骨中骨分化相關(guān)基因：骨橋蛋白（osteopontin，Opn）、骨鈣素（osteocalcin，Ocn）、成骨轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcri

8、ption factor2，Runx2)相對表達量明顯升高，而骨分化抑制基因(peroxisome proliferator activated receptorγ1，PPARγ1)和（peroxisome proliferator activated receptorγ2，PPARγ2）相對表達量顯著降低；免疫組化結(jié)果顯示Runx2蛋白表達量顯著升高，PPARγ蛋白表達量無顯著性變化；利用 western blotting檢測 PP5