在體肥厚心肌細胞實現(xiàn)鈣調神經磷酸酶Aβ基因沉默的研究.pdf

1、背景與目的：心肌肥大被公認為是心血管疾病發(fā)病和死亡的獨立危險因素，鈣調神經磷酸酶(CaN)已被證明在心肌肥大過程中扮演重要角色。目前最常用的CaN抑制劑環(huán)孢素A(CsA)及FK506雖可通過干擾CaN通路抑制心肌肥大的發(fā)生發(fā)展，但二者的免疫抑制等副作用不適于臨床廣泛應用，因而探索安全有效的CaN通路干預手段對心肌肥大的防治具有十分重要的意義。 本研究采用RNA干擾(RNAi)技術，首先在細胞水平上篩選針對CaN AβmRNA的有

2、效干擾序列；然后在整體動物水平探索有效心肌組織轉染途徑；最后進行腎性高血壓肥厚心肌組織轉染抑制CaNAβ基因表達。旨在為改善非病毒載體的轉染效率、獲得相對廣泛的在體心肌細胞轉染提供具有一定可行性的新思路；在整體動物水平上抑制心肌CaNAβ基因表達，為心肌肥大防治探索一種安全、有效的新途徑。 方法： (一)有效靶序列的篩選：針對CaNAβ基因的3個RNAi位點構建小發(fā)夾RNA(shRNA)表達載體(si1280，si1539，si

3、1053)，轉染乳鼠心肌細胞。實驗分組：空白對照組，不加入任何處理因素；醛固酮(Aid)組：每孔加入Aid 10<'-9>mol/L；si1280轉染組，si1539轉染組，si1053轉染組，陰性對照(siGFP轉染)組(每孔除加入Aid外，分別轉染不同的shRNA表達質粒)。轉染48h后檢測心肌細胞直徑、CaN Aβ及肥大相關基因ANF、β-MHC的mRNA水平。 (二)整體動物水平上探討心肌有效轉染途徑：以PLacZ為報告

4、基因，將成年大鼠分為空白對照組(生理鹽水心包腔內注射后超聲導入)；轉染質粒心包腔內注射組及其陰性對照組：質粒(陰性對照組用生理鹽水)+微泡+酶的混合物心包腔內注射，超聲導入；轉染質粒舌下靜脈注射組及其陰性對照組：質粒(陰性對照組用生理鹽水)+微泡混合液經舌下靜脈注射，超聲導入。轉染6天后處死，進行心、肝、腎、肺組織X-gal染色，觀察心肌細胞轉染情況及心外組織目的基因的表達。 (三)在體心肌誘導CaNAβ基因沉默，成年大鼠隨機分

5、為空白對照組；“一腎一夾”高血壓心肌肥大模型組； 心包腔內途徑CaNAβ干擾組及其陰性對照組；舌下靜脈途徑CaNAβ干擾組及其陰性對照組。轉染6天后處死，測定血漿心肌酶(CK，CK-MB，LDH)、轉氨酶(GPT,GOT)及腎功能(Cr，UN，Ua)指標。取心肌組織檢測CaN AβmRNA水平，CaNAβ免疫熒光觀察蛋白表達。 結果：(一)Aid模型組與siGFP陰性對照組細胞直徑及CaN Aβ、ANF、β-MHCmRN

6、A水平較對照組明顯增加(P<0.05)，Aid模型組及陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。與陰性對照組比較，si1280、si1539、si1053轉染組細胞直徑及CaN Aβ、ANF mRNA水平降低(P<0.05)，si1280，si1053組β-MHCmRNA水平降低(P<0.05)。三個干擾組之間CaNAβmRNA水平比較無差異(P>0.05)，si1280組細胞直徑小于si1539及si1053組(P<0.05)，si

7、1280 ANFmRNA水平較si1539、si1053明顯降低(P<0.05)，si1280組β-MHC mRNA水平較si1539組降低(P<0.05)，與si1053組比較無明顯差異(P>0.05)。 (二)在體心肌轉染報告基因后，僅有心包腔內注射組大鼠心外膜下部分心肌細胞可見藍染；各組大鼠肝、腎、肺組織x-gal染色陰性。 (三)在體心肌CaNAβsiRNA表達質粒轉染后，轉染各組與心肌肥大模型組CaN AB m

8、RNA水平比較無差異(P>0.05)，但免疫熒光結果顯示心包腔內途徑CaNAβ干擾組較心肌肥大模型組心外膜下部分心肌熒光減弱。 結論：RNAi技術抑制CaN Aβ基因表達可有效減輕Aid誘導的心肌細胞肥大程度；CaNAβ基因中si1280(21bp)片段為實現(xiàn)RNAi的更有效片段；微泡+酶類心包腔內注射超聲導入的方法可有效改善非病毒載體在體心肌的轉染效率，同時具有一定的靶向性，但總的轉染范圍仍然有限；采用這一方法進一步進行“一腎