在體肥厚心肌細胞實現(xiàn)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ基因沉默的研究.pdf

1、背景與目的：心肌肥大被公認為是心血管疾病發(fā)病和死亡的獨立危險因素，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)已被證明在心肌肥大過程中扮演重要角色。目前最常用的CaN抑制劑環(huán)孢素A(CsA)及FK506雖可通過干擾CaN通路抑制心肌肥大的發(fā)生發(fā)展，但二者的免疫抑制等副作用不適于臨床廣泛應(yīng)用，因而探索安全有效的CaN通路干預(yù)手段對心肌肥大的防治具有十分重要的意義。 本研究采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，首先在細胞水平上篩選針對CaN AβmRNA的有

2、效干擾序列；然后在整體動物水平探索有效心肌組織轉(zhuǎn)染途徑；最后進行腎性高血壓肥厚心肌組織轉(zhuǎn)染抑制CaNAβ基因表達。旨在為改善非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率、獲得相對廣泛的在體心肌細胞轉(zhuǎn)染提供具有一定可行性的新思路；在整體動物水平上抑制心肌CaNAβ基因表達，為心肌肥大防治探索一種安全、有效的新途徑。 方法： (一)有效靶序列的篩選：針對CaNAβ基因的3個RNAi位點構(gòu)建小發(fā)夾RNA(shRNA)表達載體(si1280，si1539，si

3、1053)，轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞。實驗分組：空白對照組，不加入任何處理因素；醛固酮(Aid)組：每孔加入Aid 10<'-9>mol/L；si1280轉(zhuǎn)染組，si1539轉(zhuǎn)染組，si1053轉(zhuǎn)染組，陰性對照(siGFP轉(zhuǎn)染)組(每孔除加入Aid外，分別轉(zhuǎn)染不同的shRNA表達質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染48h后檢測心肌細胞直徑、CaN Aβ及肥大相關(guān)基因ANF、β-MHC的mRNA水平。 (二)整體動物水平上探討心肌有效轉(zhuǎn)染途徑：以PLacZ為報告

4、基因，將成年大鼠分為空白對照組(生理鹽水心包腔內(nèi)注射后超聲導(dǎo)入)；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒心包腔內(nèi)注射組及其陰性對照組：質(zhì)粒(陰性對照組用生理鹽水)+微泡+酶的混合物心包腔內(nèi)注射，超聲導(dǎo)入；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒舌下靜脈注射組及其陰性對照組：質(zhì)粒(陰性對照組用生理鹽水)+微泡混合液經(jīng)舌下靜脈注射，超聲導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染6天后處死，進行心、肝、腎、肺組織X-gal染色，觀察心肌細胞轉(zhuǎn)染情況及心外組織目的基因的表達。 (三)在體心肌誘導(dǎo)CaNAβ基因沉默，成年大鼠隨機分

5、為空白對照組；“一腎一夾”高血壓心肌肥大模型組； 心包腔內(nèi)途徑CaNAβ干擾組及其陰性對照組；舌下靜脈途徑CaNAβ干擾組及其陰性對照組。轉(zhuǎn)染6天后處死，測定血漿心肌酶(CK，CK-MB，LDH)、轉(zhuǎn)氨酶(GPT,GOT)及腎功能(Cr，UN，Ua)指標。取心肌組織檢測CaN AβmRNA水平，CaNAβ免疫熒光觀察蛋白表達。 結(jié)果：(一)Aid模型組與siGFP陰性對照組細胞直徑及CaN Aβ、ANF、β-MHCmRN

6、A水平較對照組明顯增加(P<0.05)，Aid模型組及陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。與陰性對照組比較，si1280、si1539、si1053轉(zhuǎn)染組細胞直徑及CaN Aβ、ANF mRNA水平降低(P<0.05)，si1280，si1053組β-MHCmRNA水平降低(P<0.05)。三個干擾組之間CaNAβmRNA水平比較無差異(P>0.05)，si1280組細胞直徑小于si1539及si1053組(P<0.05)，si

7、1280 ANFmRNA水平較si1539、si1053明顯降低(P<0.05)，si1280組β-MHC mRNA水平較si1539組降低(P<0.05)，與si1053組比較無明顯差異(P>0.05)。 (二)在體心肌轉(zhuǎn)染報告基因后，僅有心包腔內(nèi)注射組大鼠心外膜下部分心肌細胞可見藍染；各組大鼠肝、腎、肺組織x-gal染色陰性。 (三)在體心肌CaNAβsiRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染各組與心肌肥大模型組CaN AB m

8、RNA水平比較無差異(P>0.05)，但免疫熒光結(jié)果顯示心包腔內(nèi)途徑CaNAβ干擾組較心肌肥大模型組心外膜下部分心肌熒光減弱。 結(jié)論：RNAi技術(shù)抑制CaN Aβ基因表達可有效減輕Aid誘導(dǎo)的心肌細胞肥大程度；CaNAβ基因中si1280(21bp)片段為實現(xiàn)RNAi的更有效片段；微泡+酶類心包腔內(nèi)注射超聲導(dǎo)入的方法可有效改善非病毒載體在體心肌的轉(zhuǎn)染效率，同時具有一定的靶向性，但總的轉(zhuǎn)染范圍仍然有限；采用這一方法進一步進行“一腎