鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶及鋅指轉(zhuǎn)錄因子在大鼠鈣化主動(dòng)脈中的作用.pdf

1、目的：血管壁上鈣過量沉積稱為血管鈣化。動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎功能衰竭、糖尿病、高血壓等疾病過程中均有血管鈣化，其程度與疾病的嚴(yán)重性呈正相關(guān)，并隨年齡的增長而逐漸惡化。心血管系統(tǒng)鈣化包括動(dòng)脈內(nèi)膜（動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)鈣化）、動(dòng)脈中層（Monckeberg's sclerosis）和心臟瓣膜鈣化，無論發(fā)生在哪個(gè)部位，都會(huì)引起血流動(dòng)力學(xué)和機(jī)械力學(xué)的改變，并增加卒中和猝死的危險(xiǎn)。近幾年冠狀動(dòng)脈鈣化對(duì)于心血管事件的預(yù)測(cè)價(jià)值備受關(guān)注，較無鈣化者，任何程度

2、的冠狀動(dòng)脈鈣化整體相對(duì)危險(xiǎn)度為4.3，3～5年冠心病事件（心肌梗死或心源性死亡）增加4倍。深入研究血管鈣化的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)血管鈣化的發(fā)生，具有重要的臨床意義。
　　 目前研究表明，血管鈣化是由細(xì)胞和分子參與的、類似于骨形成的主動(dòng)過程。許多因素都參與了這一過程的調(diào)節(jié)。近年證實(shí)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，組織分布廣泛，通過使底物NFATs去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活下游基因

3、包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子（GATA-6）等的轉(zhuǎn)錄，參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)。研究證實(shí)CaN及GATA-6在心肌細(xì)胞肥大和骨代謝中具有一定作用。CaN及GATA-6是否參與血管鈣化的調(diào)節(jié)過程，目前國內(nèi)外尚未見有相關(guān)報(bào)道。
　　 本試驗(yàn)采用華法令和維生素D3建立大鼠血管鈣化模型，測(cè)定主動(dòng)脈CaN mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性和GATA-6 mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)，并觀察CaN特異性抑制劑環(huán)孢霉素A（CsA）對(duì)CaN mRNA、蛋白質(zhì)及GATA-

4、6m RNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)及對(duì)血管鈣化的影響，初步探討CaN、GATA-6對(duì)血管鈣化的調(diào)節(jié)作用，為臨床防治血管鈣化提供新的思路。
　　 方法：4w SD雄性大鼠36只，體重80～90g，隨機(jī)分為3組，每組12只。A組：對(duì)照組；B組：鈣化組：C組：環(huán)孢霉素A組；實(shí)驗(yàn)第1-8天，各組均給予維生素K115mg·kg-1·d-1，皮下注射。同時(shí)，c組另給予環(huán)孢霉素A10mg·kg-1·d-1腹腔注射；A組和B組分別給予等量生理鹽水腹腔注

5、射。第3天開始，B、C組另給予維生素D33×105U·kg-1·d-1，皮下注射，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第5天，及華法令15mg·100g-1，12h一次，皮下注射，持續(xù)至第8天；對(duì)照組在相同時(shí)間給予等量生理鹽水皮下注射。實(shí)驗(yàn)第9天，所有動(dòng)物麻醉后處死。開胸，暴露出心臟，分離胸主動(dòng)脈，并向下剖開腹部，分離出腹主動(dòng)脈，從主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈分叉處剪下主動(dòng)脈。取材后每組各取6只用于CaNB1、GATA-6免疫組化染色、CaNAα mRNA、GATA-6

6、 mRNA原位雜交測(cè)定和透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的變化；6只用于堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定。將免疫組織化學(xué)和原位雜交結(jié)果應(yīng)用Image-Pro Plus圖象分析軟件，分別計(jì)算各組主動(dòng)脈組織相同面積內(nèi)陽性細(xì)胞的累積光密度值（integrated optic density，IOD）。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（）±s）表示，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，首先對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，組間資料比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用

7、LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）HE染色結(jié)果示：對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整，中層血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）排列整齊；鈣化組和環(huán)孢霉素A組大鼠主動(dòng)脈中層VSMCs排列紊亂，彈力纖維迂曲斷裂。（2）透射電鏡下可見鈣化大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈空泡變性，線粒體水腫，嵴數(shù)量減少，排列紊亂，部分嵴和細(xì)胞膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，有脫顆?，F(xiàn)象，部分膜融合或消失，吞飲小泡數(shù)量減少，細(xì)胞核輕度水腫，部分雙層核

8、膜融合或消失，核輕度不規(guī)則；平滑肌細(xì)胞線粒體大部分嵴和部分核膜融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，有脫顆?，F(xiàn)象，部分核膜融合；平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)中可見鈣鹽沉積，有外膜包裹。（3）免疫組織化學(xué)結(jié)果示：對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見少量CaNB1蛋白表達(dá)，主要位于胞漿內(nèi)；鈣化組大鼠主動(dòng)脈CaNB1蛋白（8731.93±469.92）較對(duì)照組（5500.95±982.57）表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNB1蛋白（7712.79±539

9、.20）較對(duì)照組（5500.95±982.57）表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNB1蛋白（7712.79±539.20）較鈣化組（8731.93±469.92）表達(dá)減少（P＜0.05）；對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見少量GATA-6蛋白表達(dá)，主要位于胞漿內(nèi)；鈣化組大鼠主動(dòng)脈GATA-6蛋白（7660.05±794.99）較對(duì)照組（2484.51±369.20）表達(dá)增加（P＜0.05）；CsA組大鼠主動(dòng)脈GATA-6蛋白（65

10、08.20±821.83）較對(duì)照組（2484.51±369.20）表達(dá)明顯（P＜0.05）；CsA組大鼠主動(dòng)脈GATA-6蛋白（6508.20±821.83）較鈣化組（7660.05±794.99）表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。（4）原位雜交結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見GATA-6 mRNA表達(dá)，主要位于胞漿中；鈣化組大鼠主動(dòng)脈CaNAα mRNA（26420.97±1697.97）較對(duì)照組（10302.17±2636.06）表達(dá)明顯

11、增加（P＜0.01）；CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNAα mRNA（16775.25±4029.59）較對(duì)照組（10302.17±2636.06）表達(dá)明顯增加（P＜0.01），CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNAα mRNA（16775.25+4029.59）與鈣化組（26420.97±1697.97）比較表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見少量GATA-6mRNA表達(dá)，主要位于胞漿內(nèi)；鈣化組大鼠主動(dòng)脈GATA-6mRNA（16622.0

12、4±1449.89）較對(duì)照組（7608.71±684.26）表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；CsA組大鼠主動(dòng)脈GATA-6 mRNA（10743.99±1060.04）較對(duì)照組（7608.71±684.26）表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；CsA組大鼠主動(dòng)脈GATA-6 mRNA（7712.79±539.20）較鈣化組（16622.04±1449.89）表達(dá)減少（P＜0.01）。（5）鈣化組ALP活性（463.38±65.09U·gprot

13、-1）較對(duì)照組（360.04±49.01 U·gprot-1）增加（P＜0.05）；CsA組ALP活性（479.78±74.67U-1gprot）較對(duì)照組（360.04±49.01 U·gprot-1）明顯增加（P＜0.01），與鈣化組（463.38±65.09U·gprot-1）比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)采用華法令和維生素D3皮下注射成功地建立了大鼠主動(dòng)脈鈣化模型，并且在透射電鏡下觀察了鈣化大鼠