鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在壓力超負荷致左室舒張功能不全中的作用機制研究.pdf

1、前言
　　舒張性心力衰竭（也稱射血分數(shù)保留的心力衰竭）是目前基礎和臨床研究的熱點，因其在發(fā)病機理和臨床特點等方面有別于收縮性心力衰竭，好發(fā)于伴有高血壓、糖尿病的人群及老年女性人群。而左室舒張功能不全是舒張性心力衰竭的最早期表現(xiàn)，其特點為心室舒張延遲和/或順應性減低。關于正常心臟如何在損傷因子作用下發(fā)展到舒張功能不全以及如何由舒張功能不全進展到舒張性心力衰竭，目前研究較少，一方面是由于缺乏公認的舒張功能不全的動物模型，另一方面也在于

2、舒張性心力衰竭的概念近年才受到重視。和收縮性心力衰竭的治療能夠有效逆轉(zhuǎn)和/或延緩左室重構(gòu)不同，舒張性心力衰竭的處理目前主要以治療和糾正原發(fā)病為主（2012年歐洲急慢性心力衰竭治療指南），拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌激活在收縮性心力衰竭患者能顯著降低心衰住院率和死亡率，而在舒張性心力衰竭患者目前尚沒有臨床研究證實其效益。
　　鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)及其信號通路被證實在高血壓心肌肥厚的病理性心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用，而高

3、血壓也是引起舒張功能不全和舒張性心力衰竭最常見的原因。那么鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路在壓力超負荷條件下對在心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用的心肌細胞和心臟成纖維細胞的作用機制如何還未完全明確。
　　筆者進行了一項薈萃分析結(jié)果顯示舒張性心力衰竭患者長期應用ACEI類藥物可以降低全因死亡率，卻未能降低心衰死亡率和全因再入院率，因此，對于舒張性心力衰竭尤其是早期舒張功能不全的識別和機制研究，有助于對此類患者的早期干預和改善預后。本研究首先擬選擇舒

4、張功能不全的代表性動物模型，進行評價，然后從分子機制水平，以心肌細胞和心臟成纖維細胞為主要研究對象以期初步闡明鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在壓力超負荷致左室舒張功能不全中的作用，最后通過動物水平藥物干預的效果和機制探討，從而明確鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在壓力超負荷引起的左室舒張功能障礙過程中的作用機理，為臨床預防和治療左室舒張功能不全和舒張性心力衰竭提供理論依據(jù)和干預靶點。
　　第一部分壓力超負荷致左室舒張功能不全動物模型的觀察和評價
　　目的:采

5、用超聲心動圖評價自發(fā)性高血壓大鼠左室舒張功能變化。
　　方法:3月齡雄性SHR和Wistar大鼠各15只，觀察時間點分別為3月齡、6月齡和9月齡（n均等于5）。采用17.5 MHz小動物高頻超聲探頭，通過M型超聲、二尖瓣口血流頻譜多普勒和二尖瓣環(huán)組織多普勒技術(shù)，評價兩組大鼠心臟結(jié)構(gòu)與舒張功能各項指標變化，并檢測血清NT-proBNP水平以及通過組織病理學觀察兩組大鼠心臟病理改變。
　　結(jié)果:和Wistar大鼠相比，3月齡SH

6、R收縮壓明顯升高（168.0±4.5 mmHg vs105.8±8.4 mmHg，P＜0.01），血清NT-proBNP水平高于同月齡Wistar大鼠(284.38±6.54 fmol/ml vs190.77±15.47 fmol/ml，P＜0.01)，超聲顯示SHR室間隔厚度(IVS)、左室后壁厚度(LVPW)均大于Wistar大鼠(IVS:1.58±0.08 mmvs1.16±0.13 mm, P＜0.01; LVPW:1.65±0

7、.08 mm vs1.39±0.18 mm, P＜0.01),E/E'升高（26.28±1.76 vs18.85±3.69，P＜0.01）;6月齡和9月齡SHR E/A、E'/A'均小于同月齡Wistar大鼠值（6月齡E/A:2.05±0.23 vs2.78±0.14，E'/A':0.57±0.06vs1.46±0.10;9月齡E/A:1.92±0.13 vs2.67±0.31;E'/A':0.61±0.07 vs1.44±0.11;所

8、有P＜0.05），NT-proBNP水平均高于Wistar大鼠值（6月齡:333.40±13.42fmol/ml vs191.42±8.25 fmol/ml;9月齡:354.31±9.39 fmol/ml vs190.36±9.13fmol/ml;所有P＜0.01），E/E'均大于同月齡Wistar大鼠值（6月齡:30.85±1.35 vs21.08±1.64;9月齡:31.77±5.22 vs21.54±2.11，所有P＜0.01）;

9、減速時間(DT)、等容舒張時間(IVRT)兩組大鼠比較差異無統(tǒng)計學意義。6月齡和9月齡SHRE/A、E'/A'均小于3月齡SHR值(P＜0.05);E/E'均大于3月齡SHR值(P＜0.05);DT、IVRT比較差異無統(tǒng)計學意義。不同月齡Wistar大鼠各項舒張功能超聲指標變化差異無統(tǒng)計學意義。SHR和Wistar大鼠隨月齡增大收縮功能變化差異均無統(tǒng)計學意義。心肌組織HE染色顯示，和Wistar大鼠相比，隨SHR月齡增大，心肌細胞進行性

10、肥大;Masson染色觀察膠原含量變化表明隨著舒張功能進行性受損，SHR心肌間質(zhì)及血管周圍膠原顯著增多。
　　結(jié)論:6月齡自發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)舒張功能異常，組織學主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大和間質(zhì)及血管周圍纖維化，高頻超聲是評價心臟結(jié)構(gòu)和舒張功能的良好手段。
　　第二部分鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在牽張的心肌細胞肥厚和凋亡中的作用探討
　　目的:明確鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對牽張后的心肌細胞肥厚和凋亡的影響及作用機制。
　　方法:酶消化+差

11、速貼壁的方法培養(yǎng)SD乳鼠原代心肌細胞，機械牽張模擬壓力超負荷條件，將培養(yǎng)的細胞隨機分為對照組、機械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶siRNA+機械牽張組、FK506+機械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶過表達+機械牽張組。收集細胞提取總蛋白和mRNA檢測細胞肥大(ANP、SAA)和凋亡(Bax/Bcl-2)相關指標表達及活性改變。
　　結(jié)果:鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾和過表達慢病毒載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染效果確定。和對照組相比，單純牽張導致明顯的細胞肥大和凋亡增加

12、，過表達鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶后產(chǎn)生和牽張類似的效應，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾以及FK506抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性后以上負性作用明顯減輕，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾的改善作用更明顯。伴隨鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的上調(diào)/下調(diào)，其下游信號分子NFAT3對應表達上調(diào)/下調(diào)。結(jié)論:鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與了機械牽張模擬壓力超負荷條件刺激下的心肌細胞肥大和凋亡過程，阻斷Calcineurin/NFAT3信號通路可以逆轉(zhuǎn)心肌肥大和減輕細胞凋亡。
　　第三部分鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在

13、牽張心臟成纖維細胞增殖、轉(zhuǎn)分化和凋亡中的作用機制探討
　　目的:明確鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對牽張后的心臟成纖維細胞增殖、轉(zhuǎn)分化和凋亡的影響及作用機制。
　　方法:酶消化法培養(yǎng)SD乳鼠原代心臟成纖維細胞，消化傳代取P2～P3代細胞，機械牽張模擬壓力超負荷條件，將培養(yǎng)的細胞隨機分為對照組、機械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶siRNA+機械牽張組、FK506+機械牽張組、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶過表達+機械牽張組。采用CCK-8法和WB檢測細胞增殖(PCN

14、A)、WB檢測轉(zhuǎn)分化(α-SMA)和凋亡（Bax/Bcl-2）相關指標的變化。同時通過TGF-β1刺激培養(yǎng)的心臟成纖維細胞，探討鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路在增殖和轉(zhuǎn)分化中所發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:CCK-8細胞活性檢測和免疫印跡檢測PCNA結(jié)果顯示，和對照組相比，單純牽張引起顯著的成纖維細胞過度增殖，過表達鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶后產(chǎn)生和牽張類似的效應，同時，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路的激活促使心臟成纖維細胞轉(zhuǎn)分化和凋亡增加，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶干擾后心臟

15、成纖維細胞增殖被抑制，轉(zhuǎn)分化和凋亡減少。不同的是，F(xiàn)K506抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性后心臟成纖維細胞增殖和凋亡有所減輕，轉(zhuǎn)分化未見明顯減少。同時我們發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激后的心臟成纖維細胞增殖和轉(zhuǎn)分化增加伴隨有Calcineurin/NFAT3信號通路的激活。
　　結(jié)論:鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶參與了機械牽張模擬壓力超負荷條件刺激下的心臟成纖維細胞增殖、轉(zhuǎn)分化和凋亡過程，阻斷Calcineurin/NFAT3信號通路可以逆轉(zhuǎn)以上負性重構(gòu)過程。

16、
　　第四部分奧美沙坦通過抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路逆轉(zhuǎn)左室舒張功能不全的實驗研究
　　目的:探討奧美沙坦能否通過下調(diào)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路而逆轉(zhuǎn)左室舒張功能不全。
　　方法:采用已經(jīng)明確出現(xiàn)舒張功能不全的6月齡SHR，隨機分為SHR+saline組和SHR+olmesartan組（n均等于12），同時以6月齡Wistar大鼠+saline作為對照組，相應給予10 ml/kg/d的生理鹽水或者2.5 mg/kg/d的奧

17、美沙坦灌胃3個月。于基線情況下及干預后超聲檢測心臟舒張功能，心臟組織HE染色和Realtime PCR觀察心肌肥厚變化，Masson三色染色觀察心肌間質(zhì)膠原沉積，免疫印跡觀察鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT3信號通路蛋白表達變化。
　　結(jié)果:舒張功能不全伴隨鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路的過度激活，而奧美沙坦能夠下調(diào)該病理性信號通路。
　　結(jié)論:奧美沙坦通過下調(diào)Calcineurin/NFAT3信號通路而起到改善壓力超負荷致左室舒張功能不全