ARB在壓力超負(fù)荷引起的心肌肥大的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、多年來(lái)的基礎(chǔ)和臨床研究顯示,心臟肥大不僅是心臟對(duì)各種刺激的代償反應(yīng),而且是許多心血管疾病發(fā)病及死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在許多內(nèi)在和外在的誘發(fā)心臟肥大的因素中,壓力超負(fù)荷是最重要的激發(fā)因素,因此確定壓力超負(fù)荷所導(dǎo)致的心臟肥大的分子機(jī)制非常重要,其中血管緊張素Ⅱ受體(AT1)的活化在心臟肥大中的作用在近年來(lái)備受矚目。越來(lái)越多的證據(jù)表明血管緊張素Ⅱ型受體拮抗劑(ARB)在降低病人血壓的同時(shí),還能夠保護(hù)靶器官并降低心血管事件的發(fā)病率和死亡率。當(dāng)前許

2、多ARB在臨床實(shí)踐中得到廣泛運(yùn)用,如氯沙坦,厄貝沙坦,替米沙坦,坎地沙坦,奧米沙坦和纈沙坦等。雖然有研究認(rèn)為一些ARB在降低血壓方面要優(yōu)于一些其他的抗高血壓藥物,如β受體阻滯劑和鈣離子通道拮抗劑,也有一些報(bào)道認(rèn)為ARB和其他的抗高血壓藥物在靶器官保護(hù)中有不同的作用。由此我們假設(shè)不同的ARB除降壓之外,它們?cè)跈C(jī)械牽張導(dǎo)致心肌肥大中的作用和機(jī)制也有可能不同。
　　AT1受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,ARB高度選擇性的結(jié)合于AT1受體并因

3、此阻斷AT1受體介導(dǎo)的各種效應(yīng)。從結(jié)構(gòu)上看,各種ARB除了有一個(gè)共同的母核一聯(lián)苯四唑環(huán)外,還有一個(gè)在該環(huán)上特異的側(cè)鏈基團(tuán),這可能是導(dǎo)致它們之間藥效和藥物代謝不同的最主要的原因。包括我們?cè)趦?nèi)許多離體研究提示不同ARB抑制AT1受體活化的作用和機(jī)制都有所不同,但目前為止還沒(méi)有報(bào)道比較不同ARB在壓力超負(fù)荷下導(dǎo)致的心臟肥厚中的作用。我們最近報(bào)道坎地沙坦能夠不依賴AngⅡ直接抑制機(jī)械牽張引起的心肌肥大,但其他的ARB是不是有同樣的作用以及它們抑

4、制機(jī)械牽張觸發(fā)的心肌肥大的分子機(jī)制還少見報(bào)道。
　　我們的結(jié)果提示不同的ARB在壓力超負(fù)荷下對(duì)心肌的保護(hù)是不一樣的,這與他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異密切相關(guān)。因此,確定機(jī)械牽張條件下的ARB的化學(xué)結(jié)構(gòu)和AT1受體的相互作用模型以及AT1受體活化的分子機(jī)制有助于我們進(jìn)一步理解機(jī)械牽張觸發(fā)的心肌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路,基于抑制AT1受體活化的方式的不同來(lái)區(qū)別ARB以及開發(fā)出既能降壓又能很好的靶器官保護(hù)的新型ARB。此外,心臟肥厚是心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因

5、素,確定心臟肥大的分子機(jī)制有利于我們進(jìn)一步預(yù)防和治療心衰。因此,結(jié)合先前的研究結(jié)果,我們就機(jī)械牽張導(dǎo)致的心肌肥大的分子機(jī)制以及不同ARB在該過(guò)程中的不同作用做些探討。
　　第一部分不同ARB逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心臟肥厚的差異比較
　　目的:比較五種ARB(氯沙坦,替米沙坦,坎地沙坦,奧米沙坦和纈沙坦)對(duì)壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心臟肥厚的作用強(qiáng)度和作用方式的差異。
　　方法:縮窄小鼠主動(dòng)脈弓(TAC)作為小鼠壓力超負(fù)荷心臟腮

6、大模型。10周齡野生型和血管緊張素原基因敲除小鼠隨機(jī)各分為7個(gè)組:sham組(sham,n=5和n=4),生理鹽水組加TAC組(saline,n=9和n=8),奧美沙坦組加TAC組(olmesartan,n=10和n=9),坎地沙坦加TAC組(condesartan,n=10和n=8),氯沙坦加TAC組(losartan,n=8和n=8),替米沙坦加TAC組(telmisartan,n=10和n=8)和纈沙坦加TAC組(valsarta

7、n,n=9和n=8)。在TAC2周后,米勒導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈行至左心室測(cè)得左心室壓力。五個(gè)指標(biāo)用于評(píng)價(jià)TAC2周后心臟腮大和重構(gòu)程度:
　　1、行小動(dòng)物高頻超聲檢查心臟心態(tài)學(xué)和評(píng)價(jià)心臟功能。
　　2、心重體重比用于比較心臟大小。
　　3、通過(guò)RT-PCR檢測(cè)肥大基因心房利鈉肽(ANP),a-骨骼肌肌動(dòng)蛋白(SAA)和肌漿網(wǎng)ATP鈣泵(SERCA2),并通過(guò)Real-timePCR進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4、病理切片染色用

8、于顯示心臟橫切面大小(ESA),心肌細(xì)胞橫切面積大小(CSA)和心肌纖維化程度。
　　結(jié)果:僅僅左心室收縮末壓(LVSP)大于155mmHg且小于180mmHg的小鼠用于統(tǒng)計(jì)分析,在各組行TAC手術(shù)中的小鼠的LVSP無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于野生型小鼠,五種ARB均能逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷引發(fā)的心臟肥厚。但對(duì)于ATGKO的小鼠纈沙坦和替米沙坦不能抑制TAC導(dǎo)致的心臟肥大的發(fā)展而氯沙坦,坎地沙坦和奧米沙坦仍然可以。
　　結(jié)論:我們的數(shù)據(jù)提示氯

9、沙坦,坎地沙坦和奧米沙坦不依賴AngⅡ而纈沙坦和替米沙坦依賴AngⅡ逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥大。
　　第二部分不同ARB在機(jī)械牽張觸發(fā)的Jak2信號(hào)通路中的作用
　　目的:通過(guò)比較奧米沙坦和替米沙坦對(duì)機(jī)械牽張觸發(fā)的心肌細(xì)胞肥大的抑制效應(yīng)來(lái)探討機(jī)械牽張觸發(fā)的Jak2信號(hào)通路。
　　方法:
　　(1)從四個(gè)化學(xué)合成的siRNA中篩選能有效干擾血管緊張素原(ATG)siRNA片段,將差速貼壁法分離得到的新生大鼠乳鼠心

10、肌細(xì)胞分為五組:分別為陽(yáng)性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA)和轉(zhuǎn)染四種針對(duì)血管緊張素原siRNA片段;用Real-time PCR方法檢測(cè)ATG來(lái)確定五個(gè)siRNA片段干擾效率,從中篩選出一個(gè)干擾效果最好的片段用于后繼實(shí)驗(yàn)。
　　(2)新生大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分為兩大組:野生型組(不轉(zhuǎn)染siRNA)和siRNA干擾組;野生型組再分成四小組分別為空白對(duì)照組(不牽張),牽張組,Olmesartan組(Olmesartan加牽張),Temisar

11、tan組(Temisartan加牽張);siRNA干擾組同樣分為空白對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siRNA不牽張),牽張組(轉(zhuǎn)染siRNA并牽張),Olmesartan組轉(zhuǎn)染(Olmesartan加siRNA并牽張),Temisartan組(Temisartan加siRNA并牽張)。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)即刻早期反應(yīng)基因c-fos,c-jun和心室利鈉肽(BNP)在各組中的表達(dá)量。Western bloting檢測(cè)AT1,Gαq11,p-E

12、RKs,Jak2,p-Jak2的各組蛋白的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　(1)相比陰性對(duì)照siRNA片段,四個(gè)化學(xué)合成siRNA片段都能不同程度的降低ATG的表達(dá),其中第三個(gè)片段干擾效率最高。
　　(2)對(duì)于野生型組,Olmesartan和Telmisartan都能夠顯著抑制因牽張引起c-fos,c-jun和BNP的表達(dá):牽張后Gαq11在心肌細(xì)胞胞漿中含量明顯升高,Olmesartan和Telmisartan都能夠顯著抑

13、制Gaq11在胞漿中的升高;牽張后,與AT1受體結(jié)合的JaK2量顯著增加,Olmesartan和Telmisartan能顯著抑制AT1和JaK2的結(jié)合;Olmesartan和Telmisartan都能夠顯著抑制因牽張引起p-ERKs的表達(dá)。對(duì)于siRNA干擾組,相對(duì)Telmisartan,Olmesartan能夠顯著抑制因牽張引起c-fos和c-jun的表達(dá)量的增加,Gαq11在心肌細(xì)胞胞漿中含量的升高以及與AT1受體結(jié)合的JaK2量和

14、p-ERKs表達(dá)量的增加。
　　結(jié)論:機(jī)械牽張能夠不依賴AngⅡ通過(guò)AT1-JaK2-ERKs信號(hào)途徑直接引起心肌細(xì)胞肥大,Olmesartan而不是Telmisartan能有效阻斷該信號(hào)通路。
　　第三部分CaMKⅡ參與機(jī)械牽張直接激活A(yù)T1受體下游的信號(hào)通路
　　目的:初步探討CaMKⅡ在機(jī)械牽張導(dǎo)致的AT1受體活化的信號(hào)通路中的作用并進(jìn)一步明確CaMKⅡ的那個(gè)結(jié)構(gòu)域參與這一重要信號(hào)通路。
　　方法:

15、　　(1)對(duì)培養(yǎng)在硅膠皿中的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后,分別用AT1受體的拮抗劑奧米沙坦和CaMKⅡ的特異性抑制劑KN-93處理并牽張,用WB檢測(cè)CaMKⅡ和p-ERK的表達(dá)。
　　(2)將接種于硅膠皿的HEK293AT1細(xì)胞分為四個(gè)大組,分別為轉(zhuǎn)染CaMKⅡδB組;轉(zhuǎn)染CaMKⅡδC組;轉(zhuǎn)染CaMKⅡδN組;轉(zhuǎn)染CaMKⅡδM組。這四個(gè)大組再亞分為不牽張和牽張兩小組。牽張10分鐘后檢測(cè)的p-ERKs的表達(dá)。
　　結(jié)果:

16、>　　(1)在心肌細(xì)胞中,在沒(méi)有AngⅡ的情況下,相對(duì)于不牽張組,機(jī)械牽張可明顯升高CaMKⅡ的表達(dá);奧米沙坦能明顯抑制機(jī)械牽張導(dǎo)致CaMKⅡ的表達(dá)升高;KN-93和奧米沙坦通過(guò)分別抑制CaMKⅡ和AT1受體明顯降低機(jī)械牽張導(dǎo)致的ERK的磷酸化。
　　(2)相對(duì)于各自的未牽張組,轉(zhuǎn)染CaMKⅡδC,CaMKⅡδN,CaMKⅡB質(zhì)粒的HEK293AT1細(xì)胞牽張后p-ERKs明顯上升,但轉(zhuǎn)染CaMKⅡδM質(zhì)粒的HEK293AT1細(xì)胞牽

17、張后p-ERKs不見升高。
　　結(jié)論:機(jī)械牽張能夠不依賴AngⅡ直接觸發(fā)AT1-CaMKⅡ-ERKs信號(hào)途徑,位于CaMKⅡ中部的自我調(diào)節(jié)域可能是參與這一通路的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　結(jié)論：
　　1.建立了升主動(dòng)脈縮窄的壓力超負(fù)荷小鼠心肌月巴大模型。
　　2.氯沙坦,坎地沙坦和奧米沙坦不依賴AngⅡ而纈沙坦和替米沙坦依賴AngⅡ逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的小鼠心臟胃巴大。
　　3.機(jī)械牽張能夠不依賴AngⅡ通過(guò)AT1-J

18、aK2-ERKs信號(hào)途徑直接弓}起心肌細(xì)胞肥大,Olmesartan而不是Telmisartan能有效阻斷該信號(hào)通路。
　　4.機(jī)械牽張能夠不依賴AngⅡ直接觸發(fā)AT1-CaMKⅡ-ERKs信號(hào)途徑,位于CaMKⅡ中部的自我調(diào)節(jié)域可能是參與這一通路的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。
　　潛在價(jià)值和創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.能夠?yàn)橐院筮M(jìn)行藥物心臟保護(hù)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的小鼠心臟肥厚模型。
　　2.發(fā)現(xiàn)并初步證實(shí)了在心肌細(xì)胞中機(jī)械牽張能導(dǎo)致JaK