微血管改變?cè)趬毫Τ?fù)荷引起的小鼠心力衰竭中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、多年來(lái),關(guān)于血管新生治療的研究就是全世界范圍的熱點(diǎn)問(wèn)題。因?yàn)槿毖切呐K疾病發(fā)病的主要原因之一,因而眾多心臟病科學(xué)家也很關(guān)注促血管新生能否早日應(yīng)用于心臟疾病的治療。隨著研究的深入,越來(lái)越多的研究證實(shí),促血管新生治療以改善心臟疾病動(dòng)物模型的心臟功能。許多心臟疾病的終末階段,大多表現(xiàn)為心力衰竭,而促進(jìn)心力衰竭進(jìn)展的一個(gè)主要原因就是心肌供氧和需氧之間的失衡,也就是血管數(shù)目減少是心力衰竭發(fā)病的一個(gè)主要原因。雖然現(xiàn)在的藥物治療可以緩解心力衰竭的癥狀

2、,但是不能完全治愈,若能促進(jìn)血管新生,來(lái)代償性的緩解心肌缺血缺氧的發(fā)病原因,勢(shì)必會(huì)帶來(lái)更好的治療效果。目前,促進(jìn)血管新生的思路大致有三種,一種是通過(guò)把促血管新生因子的基因?qū)塍w內(nèi),使得促血管因子表達(dá),增加血管的生成;一個(gè)是通過(guò)輸入內(nèi)皮細(xì)胞等促進(jìn)血管或心肌生長(zhǎng)的細(xì)胞,促進(jìn)血管新生和心肌再生,來(lái)改善心臟的重構(gòu)和功能:還有一種就是直接注入促血管新生因子的蛋白來(lái)促進(jìn)血管新生,改善心臟的氧供,挽救瀕死的心肌。這些策略在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的心臟疾病模型中都取

3、得了明顯的效果,如VEGF、FGF和HIF-1的促血管因子的治療,以及移植心臟干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等,都在實(shí)驗(yàn)中顯示了一定的效果。但是也碰到了一些問(wèn)題,如細(xì)胞的鑒定和存活等。
　　 心力衰竭作為一個(gè)常見(jiàn)的疾病和疾病過(guò)程,弄清楚心力衰竭發(fā)病的分子機(jī)制,進(jìn)一步闡明其發(fā)生的原因,會(huì)給心臟疾病的進(jìn)展帶來(lái)新的方向。結(jié)合先前的研究結(jié)果,HSF1對(duì)心臟有保護(hù)作用,但是其具體的機(jī)制和作用還沒(méi)有完全闡明。我們就HSF1對(duì)心力衰竭的影響及其機(jī)

4、制做了進(jìn)一步的研究,以求為心臟疾病的治療提供更清楚的理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因后壓力超負(fù)荷引起心力衰竭模型的建立
　　 目的:建立成年小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因后壓力超負(fù)荷引起的心力衰竭模型,探討手術(shù)中關(guān)鍵性問(wèn)題。方法:20只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)acZ組和PBS組。首先,他們分別在暫時(shí)阻斷主動(dòng)脈血流0-30s的同時(shí),左心室心腔內(nèi)分別注射100μlAd-LacZ和PBS,飼養(yǎng)兩天后,給予縮窄升主動(dòng)脈,縮窄

5、程度大于75％。4周后觀察術(shù)后小鼠體重、頸動(dòng)脈血壓和心臟超聲等變化。HE染色和X-gal染色分別觀察心室重構(gòu)和基因轉(zhuǎn)染情況。實(shí)驗(yàn)中,同時(shí)有假手術(shù)組(Sham)作對(duì)照。結(jié)果:(1)術(shù)后一周,TAC小鼠成活率達(dá)95％:(2)同Sham組比較,TAC小鼠血壓明顯升高(p＜0.01);(3)同Sham組比較,TAC小鼠術(shù)后2周心肌明顯肥厚,4周時(shí)出現(xiàn)心力衰竭(p＜0.01);(4)肉眼和顯微鏡下觀察到,X-gal染色后,LacZ組小鼠阻斷主動(dòng)脈

6、血流10s以上心臟有藍(lán)染,但10s、20s、30s之間無(wú)明顯區(qū)別。結(jié)論:(1)該方法建立成年小鼠心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因心力衰竭模型簡(jiǎn)單有效,重復(fù)性好;(2)左心室心腔直接注射法轉(zhuǎn)染Ad-LacZ基因,同時(shí)阻斷升主動(dòng)脈血流10s以上,目的基因即可表達(dá)良好。
　　 第二部分過(guò)表達(dá)p53、VEGF和Angl基因?qū)毫Τ?fù)荷引起心室重構(gòu)和心力衰竭的影響
　　 目的:觀察過(guò)表達(dá)p53、VEGF和Ang1基因?qū)毫Τ?fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰

7、竭過(guò)程的影響,尋找其發(fā)病機(jī)制及治療方法。方法:將小鼠分成三組:p53組、VEGF+Ang1組和PBS組,用開(kāi)胸心腔直接注射方法,分別轉(zhuǎn)染腺病毒攜帶的p53、VEGF+Ang1基因和PBS,轉(zhuǎn)染第2天,縮窄升主動(dòng)脈,每周做心臟超聲檢測(cè)心臟功能和形態(tài)變化,分別于縮窄主動(dòng)脈后第2天、1周、2周和4周末測(cè)量右側(cè)頸動(dòng)脈壓后取材,用HE染色、Masson三色染色、TUNEL和免疫組化觀察心臟形態(tài)變化和新生血管生成情況,用RT-PCR和Western

8、 blot檢測(cè)p53、VEGF和Angl表達(dá)情況。結(jié)果:(1)從第2周開(kāi)始PBS組左室射血分?jǐn)?shù)開(kāi)始下降,同PBS組比較,p53組下降更明顯,且小鼠死亡率升高,VEGF+Ang1組未出現(xiàn)左室射血分?jǐn)?shù)下降,未見(jiàn)到死亡小鼠(組間對(duì)比p＜0.05);(2)2-14天,縮窄升主動(dòng)脈的小鼠心室壁厚度和新生血管數(shù)逐漸升高達(dá)高峰,14-28天逐漸降低,但同PBS組比較,p53組在每一個(gè)時(shí)期都顯著降低,VEGF+Ang1組與之相反(組間對(duì)比p＜0.05)

9、;(3)在2-28天,縮窄升主動(dòng)脈的小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目逐漸增多,但同PBS組比較,P53組在每一個(gè)時(shí)期都顯著增多,VEGF+Ang1組都顯著減少(組間對(duì)比p＜0.05);(3)p53、VEGF和Angl蛋白在各自轉(zhuǎn)染組表達(dá)升高(組間對(duì)比p＜0.05)。結(jié)論:P53/VEGF和Ang1分別通過(guò)減少/增加新生血管的生成,參與了壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心室重構(gòu)和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,加劇/延緩了心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。
　　 第三部分熱休克轉(zhuǎn)錄

10、因子1對(duì)壓力超負(fù)荷引起心室重構(gòu)和心力衰竭的作用及機(jī)制的研究
　　 目的:探討熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor1,HSF1)對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成4組:HSF1基因敲除小鼠(Knockout組)、野生型小鼠(Wild-type組)、HSF1轉(zhuǎn)基因小鼠(Transgiene組)和假手術(shù)小鼠(Sham組),小鼠經(jīng)縮窄升主動(dòng)脈后,每周

11、做心臟超聲檢測(cè)心臟功能和形態(tài)變化,分別于第1周、2周和4周末測(cè)量右側(cè)頸動(dòng)脈壓后取材,用HE染色、Masson染色和Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色觀察心臟形態(tài)變化和新生血管生成情況,用Western blotting檢測(cè)磷酸化Akt和RT-PCR檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)在0d-14d,縮窄升主動(dòng)脈的小鼠心室壁厚度值和新生血管數(shù)逐漸升高達(dá)高峰,14d

12、-28d,逐漸降低,但同Wild-type組比較,Knockout組在每一個(gè)時(shí)期都顯著降低,Transgene組都顯著升高;(2)Knockout組小鼠左室射血分?jǐn)?shù)第1周就開(kāi)始下降,Wild-type組小鼠從第2周開(kāi)始下降,而Transgene組未見(jiàn)到有下降;(3)磷酸化Akt和HIF-1mRNA在Knockout組顯著降低,Transgene組顯著升高;心臟纖維化和死亡率在Knockout組顯著升高,Transgene組顯著降低。

13、r>　　 結(jié)論:HSF1通過(guò)調(diào)控血管新生,改善了壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭,其中調(diào)控HIF-1的表達(dá)可能起著重要作用。
　　 第四部分熱休克轉(zhuǎn)錄因子1對(duì)小鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制的研究
　　 目的:探討熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factorl,HSF1)對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。方法:選用HSF1基因敲除小鼠(Knockout組)、野生型小鼠(Wi

14、ld-type組)、HSF1轉(zhuǎn)基因小鼠(Transgene組)三種成年小鼠,用植塊法培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的純度,用特制硅膠牽張板培養(yǎng)后并用特制牽張器牽張24h,用CCK-8方法檢測(cè)牽張前后細(xì)胞增殖能力的變化,用RT-PCR檢測(cè)牽張前后缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)和p53mRNA的表達(dá)情況,并在Matrigel上培養(yǎng)細(xì)胞,觀察牽張前后血管形

15、成能力的變化。結(jié)果:(1)植塊法培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,純度可達(dá)99％以上;(2)牽張后,三組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力升高、HIF-1和p53mRNA表達(dá)增加、形成血管能力增強(qiáng);(3)牽張前,同Wild-type組比較,Knockout組內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力下降、p53mRNA表達(dá)增加、HIF-1mRNA表達(dá)下降、形成血管數(shù)目減少,而Transgene組內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力升高、p53mRNA表達(dá)下降、HIF-1mRNA表達(dá)升高、形成血管數(shù)目增多。牽

16、張后,仍有同樣的趨勢(shì);結(jié)論:HSF1可以促進(jìn)心肌微血管的增殖和形成血管的能力,其中上調(diào)HIF-1和下調(diào)p53的表達(dá)可能起著重要作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.建立了心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因后的壓力超負(fù)荷小鼠心力衰竭模型;
　　 2.P53/VEGF和Ang1分別通過(guò)減少/增加新生血管的生成,參與了壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心室重構(gòu)和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,加劇/延緩了心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。
　　 3.HSF1通過(guò)調(diào)控血管新生,改善

17、了壓力超負(fù)荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭,其中上調(diào)HIF-1和下調(diào)p53的表達(dá)可能起著重要作用。
　　 4.HSF1可以促進(jìn)心肌微血管的增殖和形成血管的能力,其中上調(diào)HIF-1和下調(diào)p53的表達(dá)可能起著重要作用。
　　 潛在價(jià)值和創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1.建立了心肌內(nèi)轉(zhuǎn)基因后的壓力超負(fù)荷小鼠心力衰竭模型;
　　 2.P53/VEGF和Ang1分別通過(guò)減少/增加新生血管的生成,參與了壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心室重構(gòu)和心力衰竭發(fā)