左室壓力超負(fù)荷早期單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞對心肌纖維化作用的研究.pdf

1、心肌纖維化常見于高血壓、心肌梗死、風(fēng)濕性心臟病等多種心血管疾病。目前臨床上缺乏心肌纖維化的有效干預(yù)措施，主要是由于心肌纖維化的形成和發(fā)展的調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可以通過分泌炎癥因子、生長因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等多種因子參與心肌纖維化。根據(jù)心肌組織中巨噬細(xì)胞的不同來源，可將其分為骨髓單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞和卵黃囊來源的心臟駐留巨噬細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，兩者在心肌再生、早期心臟血管形成等方面有著顯著的差異，但是兩者在心肌纖維

2、化方面的作用還沒有研究報道。因此，明確不同來源的巨噬細(xì)胞在心肌纖維化中的作用對于進(jìn)一步認(rèn)識纖維化的形成機(jī)制有著重要意義。
　　研究目的：
　　本實驗利用小鼠主動脈弓縮窄模型進(jìn)行實驗研究，探討不同來源巨噬細(xì)胞在左室壓力超負(fù)荷早期心肌纖維化中的作用。
　　研究方法：
　　1.第一部分
　　1.1.選用8～10周齡、體重20～25g的雄性C57BL/6J小鼠40只分為(n=10)：①假手術(shù)組(SHAM)、②縮窄3

3、天組(TAC3D)、③縮窄7天組(TAC7D)、④縮窄14天組(TAC14D)。各縮窄組小鼠行主動脈弓縮窄術(shù)，假手術(shù)組除不縮窄主動脈弓部，其他操作同各縮窄組;
　　1.2.采用小動物心臟超聲檢測左室射血分?jǐn)?shù)評價小鼠心臟功能;
　　1.3.采用小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值和心肌細(xì)胞直徑大小來評價心肌結(jié)構(gòu)代償性改變;
　　1.4.采用石蠟切片Masson染色，在光鏡下觀察心肌纖維化情況;
　　1.5.采用缺氧探針免疫組

4、化染色評價心肌組織微環(huán)境缺氧程度。
　　2.第二部分
　　2.1.選用8～10周齡、體重20～25g的雄性C57BL/6J小鼠40只分為(n=10)：①Vehicle+假手術(shù)組(Vehicle+SHAM)、②Vehicle+縮窄14天組(Vehicle+TAC14D)、③CCR2Inhibitor+假手術(shù)組(CCR2Inhibitor+SHAM)、④CCR2Inhibitor+縮窄14天組(CCR2Inhibitor+TAC

5、14D)。
　　2.2.采用冰凍切片免疫熒光染色，使用抗F4/80抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞，使用抗CD31抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞在心肌組織中的分布;
　　2.3.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌組織單細(xì)胞懸液中不同來源巨噬細(xì)胞亞型的比例變化;
　　2.4.采用石蠟切片Masson染色，在光鏡下觀察心肌纖維化情況;
　　2.5.采用缺氧探針免疫組化染色評價心肌組織微環(huán)境缺氧程度。
　　3.用Graph Pad Pr

6、ism6.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，p＜0.05時認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分：左室壓力超負(fù)荷模型的建立及其早期心肌纖維化的病理學(xué)變化
　　1.小鼠術(shù)后存活情況：縮窄組小鼠主動脈弓縮窄術(shù)后2周內(nèi)死亡率為6.7％(2/30)，假手術(shù)組術(shù)后2周內(nèi)無1例死亡。
　　2.小鼠心臟超聲檢測結(jié)果：與假手術(shù)組相比

7、，縮窄14天組小鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)及左室短軸縮短分?jǐn)?shù)沒有顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，提示在縮窄14天小鼠心臟功能尚處于代償階段。
　　3.左室壓力超負(fù)荷早期小鼠心肌結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的代償性變化情況：與假手術(shù)組比較，各縮窄組小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量之比均顯著增大(p＜0.05);采用麥胚凝集素標(biāo)記心肌細(xì)胞膜，冰凍切片免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，各縮窄組小鼠心肌細(xì)胞直徑均顯著增大(p＜0.05)。
　　4.左室壓力超負(fù)

8、荷早期心肌纖維化動態(tài)病理學(xué)變化情況：Masson染色顯示左室壓力超負(fù)荷早期心肌纖維化主要出現(xiàn)于血管周圍;與假手術(shù)組相比，各縮窄組均出現(xiàn)明顯血管周圍纖維化(p＜0.05)，且縮窄后3、7、14天血管周圍纖維化程度呈加劇趨勢。
　　5.左室壓力超負(fù)荷早期心肌組織微環(huán)境缺氧變化情況：取小鼠心臟橫截面進(jìn)行石蠟切片，缺氧探針免疫組化染色顯示，在左室壓力超負(fù)荷早期，隨著管周纖維化的出現(xiàn)，心肌組織微環(huán)境的缺氧情況也發(fā)生明顯變化，與假手術(shù)組相比，

9、各縮窄組小鼠心肌組織微環(huán)境缺氧程度顯著加劇(p＜0.05)。
　　第二部分：不同來源巨噬細(xì)胞在左室壓力超負(fù)荷早期心肌纖維化中作用的研究
　　1.左室壓力超負(fù)荷早期巨噬細(xì)胞在心肌組織中的分布變化情況：使用anti-F4/80抗體分別標(biāo)記巨噬細(xì)胞、使用anti-CD31抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，免疫熒光染色結(jié)果顯示，在左室壓力超負(fù)荷早期，巨噬細(xì)胞主要出現(xiàn)于心肌組織血管周圍;與假手術(shù)組相比，各縮窄組小鼠心肌組織中的血管周圍均出現(xiàn)明顯的

10、巨噬細(xì)胞聚集現(xiàn)象。
　　2.左室壓力超負(fù)荷早期不同來源巨噬細(xì)胞亞型的變化情況：使用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測假手術(shù)組和縮窄14天組小鼠心肌組織的單細(xì)胞懸液發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，縮窄14天組CCR2+巨噬細(xì)胞比例明顯增加(p＜0.05)。
　　3.使用CCR2抑制劑干預(yù)實驗小鼠，發(fā)現(xiàn)CCR2抑制劑可以使縮窄組小鼠心肌組織中聚集在血管周圍的巨噬細(xì)胞減少;可以有效減少縮窄組小鼠心肌組織單細(xì)胞懸液中CCR2+巨噬細(xì)胞的比例(p＜0.05);

11、可以有效降低縮窄組小鼠心肌組織血管周圍纖維化的程度(p＜0.05);可以在一定程度上緩解縮窄組小鼠心肌組織微環(huán)境的缺氧情況(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.心肌組織中血管周圍纖維化是左室壓力超負(fù)荷早期出現(xiàn)的顯著病理學(xué)變化;
　　2.在左室壓力超負(fù)荷早期，心肌組織血管周圍有大量巨噬細(xì)胞浸潤，心肌組織中單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞比例明顯增加，減少其比例后可在一定程度上緩解血管周圍纖維化的進(jìn)展。提示單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)