Notch1-RBP-Jk-Msx2信號通路在不同血管鈣化大鼠模型主動脈中的表達及作用.pdf

1、第一部分、Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路在糖尿病腎病血管鈣化大鼠模型主動脈中的表達及作用
　　目的：血管鈣化是糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）患者常見的大血管并發(fā)癥，也是DN患者死于心血管事件的首要原因，但對于DN易并發(fā)血管鈣化的機制仍不完全清楚。因此，本研究通過觀察糖尿病腎病血管鈣化大鼠模型主動脈鈣化及 Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路的表達情況，探討Notch1-RBP-J

2、k/Msx2信號通路在糖尿病腎病血管鈣化中的作用。
　　方法：將42只SD大鼠隨機分為正常對照組（Nor組，18只）和糖尿病腎病血管鈣化組（DN+VDN組，24只），DN+VDN組經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)4周后，予單次腹腔注射1％鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液以35mg/kg的劑量誘導(dǎo)糖尿病，Nor組予以等體積的檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ72h后測血糖，以連續(xù)3天血糖≥16.7mmol/L為糖尿病成模。2周后，如24

3、小時尿蛋白定量（24 hours urinary albumin，24-h Upro）>30mg，尿量>原尿量50%，視為制備成功的DN大鼠模型。DN成模后第2天早上9時, DN+VDN組大鼠予維生素D3（300000U/kg）肌肉注射，將尼古?。?5mg/kg）充分溶于花生油中灌胃，晚6時再灌胃1次，Nor組大鼠在同時間點予等量花生油灌胃及生理鹽水肌注。分別在第8、12和16周處死大鼠，處死前收集兩組大鼠尿液檢測24-h Upro；經(jīng)

4、腹主動脈采血檢測空腹血糖、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、血鈣（Ca）和血磷（P）。獲取胸和腹主動脈經(jīng)生理鹽水沖洗后，Von Kossa染色觀察大鼠主動脈壁中鈣鹽沉積。免疫組化檢測大鼠主動脈組織α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription f

5、actor2，Runx2）和Notch1、RBP-Jk、Msx2、Jagged1、Notch1胞內(nèi)域（intracellular Notch1 domain，N1-ICD）信號蛋白的表達。實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測各組大鼠主動脈α-SMA、平滑肌肌動蛋白22α（smooth muscle22 alpha，SM22α）、Runx2、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和Notch1、RB

6、P-Jk、Msx2、Jagged1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果：
　　1、一般情況：（1）體重：與Nor組大鼠比較,DN+VDN組大鼠體重明顯減輕（P<0.001）。（2）血糖：Nor組血糖維持在正常水平范圍內(nèi)，DN+VDN組大鼠血糖值明顯高于同時間點 Nor組（P<0.01）。（3）24-h Upro：各時間點DN+VDN組大鼠24-h Upro均較Nor組顯著升高（P<0.001），且隨時間進展，在16周時達最高。（

7、4）腎功能：DN+VDN組大鼠各時間點BUN水平均顯著高于同期Nor組（P<0.001）；與Nor組相比，第8周末DN+VDN組大鼠Scr無明顯差異，12周后DN+VDN組血Scr顯著升高（P<0.001）。（5）血Ca、P和鈣磷乘積（Ca×P）：DN+VC組大鼠各時間點血Ca較Nor組明顯上升（P<0.05）；血P在第8、12周時與Nor組無明顯差異，第16周時較Nor組顯著升高（P<0.05）；DN+VDN組Ca×P各時間點均顯著高

8、于Nor組（P<0.05）。
　　2、大鼠主動脈鈣化情況：（1）Von Kossa染色：Nor組大鼠主動脈壁上各時間點均未見明顯鈣鹽沉積， DN+VDN組大鼠第8周末時即可見血管內(nèi)膜及中膜彈性纖維間存在散在點狀沉積的棕黑色鈣鹽顆粒，隨時間進展，沉積的鈣鹽顆粒逐漸增多并融合成斑塊。（2）α-SMA和Runx2蛋白免疫組化表達情況：Nor組主動脈壁上α-SMA廣泛表達且各時間點無明顯差異，DN+VDN組較同期 Nor組表達均顯著減少（

9、P<0.05）；而 Runx2蛋白在 Nor組各時間點主動脈壁上僅極少量表達，但在DN+VDN組表達各時間點均較Nor組明顯增加（P<0.05）。
　　3、Notch1、RBP-Jk、Msx2、Jagged1和 N1-ICD信號蛋白免疫組化表達情況：Notch1、RBP-Jk、Msx2、Jagged1和N1-ICD信號蛋白在Nor組大鼠主動脈壁上均僅有散在微量表達；而DN+VDN組大鼠主動脈上Notch1、RBP-Jk、Msx2、

10、Jagged1和N1-ICD信號蛋白在第8周末表達即開始明顯增加，陽性著色深，隨時間進展，表達逐漸增多，且明顯高于Nor組（P<0.05）。
　　4、大鼠主動脈α-SMA、SM22α、Runx2和ALP mRNA的表達：Real-time PCR結(jié)果示，與Nor組大鼠各時間點相比，DN+VDN組大鼠主動脈α-SMA和SM22α mRNA表達均明顯降低（P<0.05）；而Runx2和ALP mRNA表達均顯著升高（P<0.05）。5

11、、大鼠主動脈 Notch1、RBP-Jk、Msx2和Jagged1 mRNA的表達：各時間點DN+VDN組大鼠主動脈Notch1、RBP-Jk、Msx2和Jagged1 mRNA的表達均較Nor組明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、糖尿病腎病血管鈣化時伴隨有平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變及成骨因子的激活；同時存在Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路的激活。
　　2、Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路

12、可能參與糖尿病腎病血管鈣化的發(fā)生，是其重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。
　　第二部分、Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路在慢性腎衰竭血管鈣化大鼠模型主動脈中的表達及作用
　　目的：血管鈣化（vascular calcification，VC）是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者心血管并發(fā)癥的主要表現(xiàn)，也是透析患者（CKD5D期）并發(fā)心血管事件的主要原因，了解血管鈣化發(fā)生的具體機制是預(yù)防和

13、阻斷其病理過程的關(guān)鍵。因此，本研究通過腺嘌呤聯(lián)合高磷飲食誘導(dǎo)慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）血管鈣化大鼠模型（CRF+VC），觀察大鼠主動脈鈣化情況、血管平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志α-SMA、SM22α及成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2和ALP活化情況；同時觀察CRF+VC大鼠主動脈上Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路各成員轉(zhuǎn)錄及激活情況。探討 Notch1-RBP-Jk/Msx2通路在慢性腎衰竭血管鈣化大鼠模型

14、主動脈中的表達及作用。
　　方法：將40只SD大鼠隨機分為正常對照組（Nor組，15只）和慢性腎衰竭血管鈣化組（CRF+VC組，25只），CRF+VC組第1-4周將腺嘌呤以250 mg/（kg·d）劑量灌胃及聯(lián)合1.8%高磷飼料喂養(yǎng)，第5-8周灌胃改為隔日1次；Nor組給予等量生理鹽水灌胃，普通飼料喂養(yǎng)。第4、6和8周末收集兩組大鼠尿液檢測24-h Upro；腹主動脈采血檢測BUN、Scr、血Ca和血P等。摘取胸和腹主動脈經(jīng)生理鹽

15、水沖洗后，茜素紅S染色觀察大鼠主動脈壁鈣化情況。免疫組化檢測大鼠主動脈α-SMA、Runx2及Notch1、RBP-Jk、Msx2、Jagged1、N1-ICD信號蛋白的表達。Real-time PCR檢測各組大鼠主動脈組織α-SMA、SM22α、Runx2、ALP mRNA以及Notch1信號通路相關(guān)成員mRNA表達。
　　結(jié)果：
　　1、一般情況（1）體重：與Nor組大鼠比較，CRF+VC組大鼠體重明顯減輕（P<0.01

16、）。（2）24-h Upro：與Nor組相比，CRF+VC組大鼠24-h Upro各時間點均明顯升高（P<0.05）。（3）腎功能：與Nor組相比，第4、6和8周末CRF組大鼠BUN和Scr均顯著升高（P<0.01）。（5）血Ca、P和Ca×P：CRF+VC組大鼠血Ca水平在第4和8周明顯高于Nor組（P<0.01），第6周時兩組間無明顯差異；CRF+VC組大鼠各時間點血P和Ca×P水平顯著高于Nor組（P<0.01）。
　　2、

17、大鼠主動脈鈣化特征：（1）茜素紅 S染色：Nor組大鼠主動脈壁上各時間點均未見鈣鹽沉積，CRF+VC組大鼠各時間點均可見血管壁中膜層廣泛存在呈線性連續(xù)分布的鈣化結(jié)節(jié)。（2）α-SMA和Runx2蛋白免疫組化表達：Nor組主動脈壁上α-SMA廣泛表達且各時間點無明顯差異， CRF+VC組較同期 Nor組表達均顯著減少（P<0.05）；與之相反， Runx2蛋白在Nor組主動脈壁上少量表達，在CRF+VC組各時間點表達均較Nor組顯著增加（

18、P<0.05）。
　　3、Notch1、RBP-Jk、Msx2、Jagged1和 N1-ICD信號蛋白免疫組化表達情況：Notch1、RBP-Jk、Msx2、Jagged1和N1-ICD信號蛋白在Nor組大鼠主動脈壁上僅有少量表達；CRF+VC組大鼠主動脈中可見 Notch1、RBP-Jk、Msx2、Jagged1和N1-ICD蛋白在第4周末表達即開始顯著增加，陽性著色深，第6和8周末均較Nor組表達增加（P<0.01）。

19、　　4、主動脈組織α-SMA、SM22α、Runx2和ALP mRNA的表達：Real-time PCR結(jié)果顯示，與Nor組大鼠相比，CRF+VC組大鼠主動脈中各時間點α-SMA和SM22αmRNA表達均明顯降低（P<0.01）；而Runx2和ALP mRNA表達均顯著升高（P<0.05）。
　　5、主動脈組織Notch1、RBP-Jk、Msx2和Jagged1 mRNA的表達：CRF+VC組大鼠主動脈中Notch1、RBP-Jk