鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號(hào)通路在大鼠主動(dòng)脈鈣化中的作用.pdf

1、目的：骨、牙齒之外的非骨性組織發(fā)生鈣化，伴或不伴組織壞死或損傷，均稱為異位鈣化。臨床上的異位鈣化涉及心臟瓣膜鈣化、血管鈣化、軟組織鈣化等，近年血管生物學(xué)的研究和心血管影像學(xué)（如電子光束計(jì)算機(jī)斷層掃描等）的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓及糖尿病等多種疾病常見(jiàn)的、共同的病理變化，也是形成動(dòng)脈斑塊引起管腔狹窄的重要因素之一。
　　 雖然血管鈣化是許多臨床疾病的重要特征，然而導(dǎo)致血管鈣化發(fā)病的確切機(jī)制尚不清楚。以往認(rèn)為血管鈣化

2、是衰老時(shí)出現(xiàn)的異位骨化，是鈣鹽在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)的被動(dòng)沉積。然而新近的許多研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化并不是磷酸鈣結(jié)晶在血管壁的簡(jiǎn)單而被動(dòng)的沉積，而是一種類似于骨和軟骨形成的主動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程，血管細(xì)胞（尤其是血管平滑肌細(xì)胞vascular smooth muscle cells，VSMCs）由正常的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞樣表型，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和鈣化損傷區(qū)含有多種骨基質(zhì)蛋白和成骨細(xì)胞標(biāo)志物。
　　 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，

3、CaN）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員，是唯一受Ca2+/鈣調(diào)素（calmodulin，CaM）調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶。CaN主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，組織分布廣泛，通過(guò)使其最重要的底物活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFATs）去磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，參與多種細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。研究證實(shí)CaN/NFATc信號(hào)通路在心肌細(xì)胞肥大和骨代謝中具有重要作用，還廣泛存在于免疫系統(tǒng)，調(diào)

4、節(jié)淋巴細(xì)胞生理性及病理性生長(zhǎng)、分化和發(fā)育。CaN/NFATc信號(hào)通路不僅參與成骨細(xì)胞分化和成骨作用，還是破骨細(xì)胞分化所必需的，是否參與血管鈣化的調(diào)節(jié)過(guò)程，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有報(bào)道。因此，設(shè)想通過(guò)此通路調(diào)節(jié)鈣化的血管，改善患者的臨床預(yù)后，為臨床治療展示了應(yīng)用前景。
　　 本試驗(yàn)采用華法令和維生素D3建立大鼠血管鈣化模型，測(cè)定主動(dòng)脈CaNAα、NFATc mRNA的表達(dá)、CaN和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，A

5、LP）活性，進(jìn)行CaNB1和NFATc免疫組化染色，并觀察CaN特異性抑制劑環(huán)孢霉素A（cyclosporin A，CsA）對(duì)CaN/NFATc信號(hào)通路表達(dá)及血管鈣化的影響，初步探討CaN/NFATc信號(hào)通路在血管鈣化中的調(diào)節(jié)作用，為血管鈣化的臨床防治提供新的思路。
　　 方法：4w SD雄性大鼠36只，體重80～90g，隨機(jī)分為3組，每組12只。A組：對(duì)照組；B組：鈣化組；C組：CsA組；實(shí)驗(yàn)第1-8天，各組均給予維生素K11

6、5mg·kg-1·d-1，皮下注射。同時(shí)，C組另給予CsA10m g·kg-1·d-1腹腔注射；A組和B組分別給予等量生理鹽水腹腔注射。第3天開(kāi)始，B、C組另給予維生素D33×105U·kg-1·d-1，皮下注射，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)第5天，及華法令15mg·100g-1，12h一次，皮下注射，持續(xù)至第8天；對(duì)照組在相同時(shí)間給予等量生理鹽水皮下注射。實(shí)驗(yàn)第9天，所有動(dòng)物麻醉后處死。開(kāi)胸，暴露出心臟，分離胸主動(dòng)脈，并向下剖開(kāi)腹部，分離出腹主動(dòng)脈，從

7、主動(dòng)脈根部至腹主動(dòng)脈分叉處剪下主動(dòng)脈。
　　 取材后每組各取6只用于進(jìn)行CaNB1和NFATc免疫組化染色，原位雜交測(cè)定CaNAα和NFATc mRNA。6只用于組織CaN、ALP活性測(cè)定。將免疫組織化學(xué)和原位雜交結(jié)果應(yīng)用Image-Pro Plus圖象分析軟件，分別計(jì)算各組主動(dòng)脈組織相同面積內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞的累積光密度值（integrated optic density，IOD）。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（）±s）表示，運(yùn)用SPSS

8、13.0統(tǒng)計(jì)軟件，首先對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，組間資料比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：（1）HE染色結(jié)果示對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整，中層VSMCs排列整齊；鈣化組和CsA組大鼠主動(dòng)脈中層VSMCs排列紊亂，彈力纖維迂曲斷裂。VonKossa染色示鈣化組大鼠主動(dòng)脈中層彈性纖維間有大量黑色顆粒沉積；CsA組大鼠主動(dòng)脈中層彈性纖維間亦可見(jiàn)黑色顆粒沉積；對(duì)照

9、組未見(jiàn)明顯黑色顆粒沉積。（2）免疫組織化學(xué)結(jié)果示對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見(jiàn)少量CaNB1、NFATc蛋白表達(dá)，主要位于胞漿內(nèi)：鈣化組大鼠主動(dòng)脈CaNB1、NFATc蛋白較對(duì)照組表達(dá)明顯增加；CsA組大鼠主動(dòng)脈CaNB1、NFATc蛋白較對(duì)照組達(dá)明顯增加，較鈣化組表達(dá)減少。（3）原位雜交結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈可見(jiàn)CaNAα、NFATc mRNA表達(dá)，主要位于胞漿中；鈣化組大鼠主動(dòng)脈CaNAα、NFATc mRNA較對(duì)照組表達(dá)明顯增加；CsA組

10、大鼠主動(dòng)脈CaNAα、NFATc mRNA較對(duì)照組表達(dá)明顯增加，較鈣化組表達(dá)明顯減少。（4）鈣化組CaN活性較對(duì)照組明顯增加；CsA組CaN活性較對(duì)照組明顯增加；CsA組CaN活性與鈣化組比較無(wú)顯著性差異。（5）鈣化組ALP活性較對(duì)照組增加；CsA組ALP活性較對(duì)照組明顯增加，與鈣化組比較無(wú)顯著性差異。
　　 結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)采用華法令和維生素D3皮下注射成功地建立了大鼠主動(dòng)脈鈣化模型，并且在透射電鏡下觀察了鈣化大鼠主動(dòng)脈超微結(jié)