香豬卵巢細(xì)胞生物學(xué)特性和影響母豬卵巢顆粒細(xì)胞體外成熟的因素探討.pdf

1、卵巢卵泡發(fā)育是個(gè)十分復(fù)雜的過程，經(jīng)歷卵泡發(fā)育的啟始、募集、選擇、優(yōu)勢化、排卵和黃體化等過程。同時(shí)，卵泡的生長和發(fā)育也是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的生理過程，受多種因素(激素、生長因子、芳香化酶、金屬離子、物理及化學(xué)刺激等)的影響和控制，少數(shù)卵泡最終發(fā)育為優(yōu)勢卵泡并排卵，99％以上的卵泡都將發(fā)生閉鎖。香豬是我國特有的小型豬種之一，也是醫(yī)學(xué)和繁殖學(xué)的理想模式動(dòng)物。但與其繁殖相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)研究很少。哺乳動(dòng)物中，叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族O亞家族的4個(gè)成員：FO

2、XO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6在多種生命活動(dòng)中起著廣泛的作用。近年來的研究表明，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄因子在小鼠、大鼠、人的卵巢中通過多條通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡。深入研究香豬卵巢細(xì)胞的生物學(xué)特性及FoxO蛋白在卵泡發(fā)育及發(fā)情周期中的作用及其調(diào)控機(jī)制，在提高家畜繁殖力、人的不孕癥治療、避孕手段的開發(fā)以及癌癥等疾病的防治等方面均具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法檢測了香豬卵巢中的細(xì)胞凋亡，利用免疫組織化學(xué)的方法就FoxO

3、s及幾個(gè)相關(guān)蛋白在香豬卵巢中的細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，利用流式細(xì)胞術(shù)、RIA、Western blot等方法檢測了不同直徑豬卵泡中的顆粒細(xì)胞和不同處理?xiàng)l件下的體外培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞的存活率、[Ca2+]i、E2的分泌以及FoxO3a、Bcl-2的表達(dá)水平，就其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了深入探討。 主要結(jié)論如下： 1.用TUNEL法檢測香豬卵巢中的細(xì)胞凋亡的結(jié)果表明：健康卵泡中顆粒細(xì)胞排列整齊，僅在靠近卵泡腔處有少量顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，

4、而在閉鎖卵泡中，顆粒細(xì)胞排列松散，部分進(jìn)入卵泡腔，且凋亡比例較高．香豬卵巢切片的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果表明：抑制素α在發(fā)育各階段卵泡的顆粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)；PKB在香豬卵巢原始卵泡的顆粒細(xì)胞、次級(jí)卵泡和有腔卵泡的近卵泡膜細(xì)胞的顆粒細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，在閉鎖卵泡、黃體和卵巢間質(zhì)細(xì)胞中均不表達(dá)；FoxO1在原始卵泡、次級(jí)卵泡、有腔卵泡的顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)，在閉鎖卵泡中凋亡顆粒細(xì)胞及黃體細(xì)胞中沒有表達(dá)；FoxO3a在發(fā)育各階段卵泡的顆粒細(xì)胞、

5、顆粒黃體細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)；FoxO1和FoxO3a均在卵母細(xì)胞中表達(dá)；未檢測到FoxO4在香豬卵巢細(xì)胞中的表達(dá)；Bax和Bcl-2在各發(fā)育階段卵泡的顆粒細(xì)胞，黃體細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，表明抑制素α，PKB、FoxOs、Bax和Bcl-2在香豬卵巢中呈卵泡發(fā)育階段特異性和細(xì)胞特異性表達(dá)，可能在香豬卵泡的發(fā)育、閉鎖和黃體化中起重要調(diào)控作用。 2.為了研究FoxO6在豬生殖系統(tǒng)的作用，本實(shí)驗(yàn)從4個(gè)成年豬卵

6、巢和4只成年小鼠的腦組織中提取RNA，根據(jù)已報(bào)道的小鼠FoxO6基因引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果從小鼠腦組織中擴(kuò)增出一條約2500 bp的片段，而豬卵巢組織中未見此片段。因此，F(xiàn)oxO6基因可能在成年豬卵巢中不表達(dá)。 3.為了研究豬卵泡發(fā)育過程中影響pGC生長和卵泡閉鎖的因素，本實(shí)驗(yàn)中用機(jī)械法從豬卵巢分離有腔卵泡，按直徑大小分為3組：小卵泡( 1.5-3 mm)、中卵泡(3-5mm)和大卵泡(≥5 mm)，統(tǒng)計(jì)健康卵泡和閉鎖卵泡分

7、別所占比率，分離pGC并收集pFF。用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測pGC存活率和Fluo 3-AM探針標(biāo)記pGC檢測[Ca2+]i，用Western blot檢測pGC內(nèi)FoxO3a表達(dá)水平，用化學(xué)發(fā)光法檢測pFF中E2的濃度。結(jié)果表明：隨有腔卵泡直徑的增大，閉鎖卵泡的比率逐漸降低(P＜0.05)，健康卵泡的比率逐漸增加(P＜0.05)；pGC存活率逐漸升高(P＜0.05)；pGC內(nèi)[Ca2+]i逐漸降低(P＞

8、0.05)；pGC內(nèi)FoxO3a表達(dá)水平逐漸升高(P＜0.05)；pFF中E2的濃度逐漸升高(P＜0.05)。表明[Ca2+]i和FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控不同直徑有腔卵泡中pGC的生長和凋亡，從而調(diào)節(jié)豬有腔卵泡的生長，發(fā)育和閉鎖。 4.為研究細(xì)胞外游離Ca2+對(duì)pGC的影響，在豬顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中添加CaCl2或Ca2+螯合劑EGTA，分別于0h、6h、24 h和48 h收集pGC和培養(yǎng)液。用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃

9、度([ca2+]i)、用Western blot檢測pGC內(nèi)FoxO3a表達(dá)水平、用RIA法檢測培養(yǎng)液中E2的濃度。結(jié)果表明：(1)培養(yǎng)液中50 mg/mL CaCl2對(duì)pGC的[Ca2+]i沒有顯著影響；50 μg/mL EGTA顯著降低了豬顆粒細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(P＜0.05)，但500 μg/mL EGTA反而對(duì)pGC的[Ca2+]i無顯著影響。(2)培養(yǎng)液中添加CaCl2 6 h可以顯著提高pGC內(nèi)FoxO3a的表達(dá)，而添加EG

10、TA顯著抑制了pGC內(nèi)FoxO3a的表達(dá)(p＜0.05)，且抑制程度呈劑量依賴性關(guān)系。(3)培養(yǎng)液中添加CaCl2對(duì)pGC內(nèi)E2的分泌起抑制作用，而添加EGTA對(duì)pGC內(nèi)E2的分泌起顯著的促進(jìn)作用(P＜0.05)，且E2分泌提高幅度與EGTA的添加量呈劑量依賴性正相關(guān)。另外，體外培養(yǎng)的pGC中E2的分泌隨時(shí)間的延長逐漸升高的趨勢，體外培養(yǎng)的pGC可能存在一個(gè)自成熟的過程。所以，細(xì)胞外鈣離子可能通過FoxO3a信號(hào)通路來調(diào)控體外培養(yǎng)的pG

11、C的生長、凋亡和成熟。 5.為研究pGC中Ca2+信號(hào)通路是否受PI3K/PKB/FoxO信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，用2ng/mL FSH、1 mmol/L EGTA(一種Ca2+螯合劑)、10 μmol/L LY294002(一種PI3K的特異性抑制劑)以及FSH+EGTA、EGTA+LY和FSH+EGTA+LY共處理體外培養(yǎng)的pGC，用流式細(xì)胞儀檢測pGC存活率、用Western blot檢測pGC內(nèi)FoxO3a等蛋白表達(dá)水平、用RI

12、A法檢測培養(yǎng)液中E2的濃度。結(jié)果表明：處理后2h，各處理組細(xì)胞存活率差異不顯著，E2分泌量差異不顯著；處理后6h，EGTA和LY294002共處理組細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.05)，其他各組細(xì)胞存活率差異不顯著(P＞0.05)，EGTA處理組FoxO3a的表達(dá)水平受抑制，而LY294002處理組pGC內(nèi)FoxO3a的表達(dá)水平升高，F(xiàn)SH對(duì)pGC中Bcl-2的表達(dá)起促進(jìn)作用，而EGTA起抑制作用，添加LY促進(jìn)了Bcl-2的表達(dá)；處理后2