硫化氫對營養(yǎng)誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病損傷的治療作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是指除酒精和其他明確的損肝因素所致外，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，包括非酒精性單純性脂肪肝以及由其演變的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)和肝硬化。其中NASH是以肝細(xì)胞喪失、脂肪變性、氣球樣變、炎性壞死及纖維化形成為特征的病理狀態(tài)。NASH

2、常見于Ⅱ型糖尿病、高血壓、高脂血癥及肥胖患者。
　　NASH的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，且未完全闡明。目前被多數(shù)學(xué)者所接受的是1998年由DayCP所提出的“二次打擊學(xué)說”。在“初次打擊”誘發(fā)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的前提下，以氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為軸心的“二次打擊”在NASH的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　NASH的持續(xù)存在已成為肝硬化甚至肝癌的重要因素之一。其中15％-20％的NASH患者在10-20年內(nèi)可進(jìn)展為肝硬化。隨著中國物質(zhì)生活水平的

3、日益提高，NASH的患病人數(shù)持續(xù)增加，其年齡也呈現(xiàn)低齡化趨勢。針對NASH的藥物研究也成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　氣體信號(hào)分子硫化氫(H2S)，作為一種氣體遞質(zhì)，不需借助任何特殊的運(yùn)輸工具就可以自由快速地通過細(xì)胞膜，H2S在心血管、呼吸、消化、神經(jīng)等系統(tǒng)中具有重要生理作用。研究發(fā)現(xiàn)H2S具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)，抗凋亡以及抗纖維化作用。
　　內(nèi)源性H2S是否參與NASH發(fā)病過程，現(xiàn)在尚無研究。本課題的研究目的就是闡明

4、內(nèi)源性H2S在大鼠NASH發(fā)病過程中的變化;并進(jìn)一步通過給以外源性的H2S進(jìn)行治療，闡明H2S在大鼠NASH發(fā)病過程中的作用，同時(shí)為NASH的藥物研究提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分:觀察大鼠NASH發(fā)病過程中內(nèi)源性H2S的變化
　　營養(yǎng)誘發(fā)動(dòng)物模型（食物喂養(yǎng)法）是NASH動(dòng)物模型建立最常用的方法。其中蛋氨酸/膽堿缺乏飼料(，methionine-cholinedeficientdiet，MCD)和高脂飼料（hig

5、h-fatdiet，HFD）為誘導(dǎo)NASH的兩種常見飼料。
　　1.MCD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，分1天，7天，3周，6周，8周時(shí)間梯度觀察血清中H2S水平，肝臟中H2S的生成能力;應(yīng)用RT-PCR法和Westernblotting法考察肝臟中H2S生成酶如胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的變化。
　　2.HFD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，分1天，7天，3周，6周，8周時(shí)間梯度觀察

6、血清中H2S水平，肝臟中H2S的生成能力;應(yīng)用RT-PCR法和Westernblotting法分別考察肝臟中H2S生成酶如CBS和CSE的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的變化。
　　第二部分:外源性H2S對大鼠NASH肝損傷的保護(hù)作用
　　1.MCD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔注射硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)治療8周，觀察肝臟病理損傷、肝功能損傷指標(biāo);觀察肝細(xì)胞凋亡情況。
　　2.HFD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔

7、注射硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)治療8周，觀察肝臟病理損傷、肝功能損傷指標(biāo);觀察肝細(xì)胞凋亡情況。
　　第三部分:H2S大鼠緩解NASH肝損傷的作用機(jī)制
　　1.MCD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔注射硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)治療8周，觀察氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)與炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo);觀察肝臟脂質(zhì)沉積以及脂肪酸代謝基因表達(dá);
　　2.HFD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔注射硫氫化鈉（NaHS，H2S供體）治療8

8、周，觀察氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)與炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo);觀察肝臟脂質(zhì)沉積以及脂肪酸代謝基因表達(dá);
　　結(jié)果:
　　第一部分:大鼠NASH發(fā)病過程中內(nèi)源性H2S的變化
　　1.MCD飼料誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，3周后，血清和肝臟中H2S水平降低，肝臟中CBS和CSE的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平下降。
　　2.HFD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，6周時(shí)，發(fā)現(xiàn)血清和肝臟中H2S水平降低，肝臟中CBS和CSE的mRNA水平和蛋白表達(dá)水

9、平下降。
　　第二部分:外源性H2S對大鼠NASH肝損傷的保護(hù)作用
　　1.MCD飼料誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔注射硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)治療8周。
　　(1)病理檢測:HE染色見正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞大小均勻，無變性壞死;MCD模型組大鼠肝臟肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝板排列紊亂，肝細(xì)胞普遍脂肪變性，炎癥壞死及出血明顯，炎癥細(xì)胞侵潤，肝細(xì)胞氣球樣變。H2S治療組炎癥細(xì)胞侵潤和肝

10、細(xì)胞氣球樣變得到明顯減輕。
　　(2)凋亡檢測:TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)MCD模型組大鼠肝臟中凋亡細(xì)胞數(shù)目增加。H2S治療組與模型組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。
　　(3)肝臟損傷指標(biāo):MCD模型組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平增加;H2S治療組與模型組相比，ALT和AST水平降低。
　　2.HFD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔注射硫氫化鈉（NaHS，H2S供體）治療8周。
　　

11、(1)病理檢測:HE染色見正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞大小均勻，無變性壞死;HFD模型組大鼠肝臟肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝板排列紊亂，肝細(xì)胞普遍脂肪變性，炎癥壞死及出血明顯，炎癥細(xì)胞侵潤，肝細(xì)胞氣球樣變。H2S治療組炎癥細(xì)胞侵潤和肝細(xì)胞氣球樣變得到明顯減輕。天狼星紅(SiriusRed)染色發(fā)現(xiàn)HFD模型組大鼠臟肝纖維化明顯，H2S治療大鼠臟肝纖維化得以緩解。
　　(2)凋亡檢測:TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)HFD模型組大

12、鼠肝臟中凋亡細(xì)胞數(shù)目增加;H2S治療組與HFD模型組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少。
　　(3)肝臟損傷指標(biāo):HFD模型組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平增加;H2S治療組與模型組相比，ALT和AST水平降低。
　　(4)胰島素耐受:HFD模型組大鼠空腹血糖水平增加，空腹胰島素水平變化不明顯，胰島素抵抗指數(shù)增加;H2S治療降低了HFD模型組大鼠的空腹血糖水平，降低了胰島素抵抗指數(shù)。
　　第

13、三部分:外源性H2S大鼠緩解NASH肝損傷的作用機(jī)制
　　1.MCD飼料誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔注射硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)治療8周。
　　(1)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):MCD模型組大鼠肝臟中丙二醛（MDA，脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志分子）水平增加，CYP2E1和HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加;H2S治療組與模型組相比，MDA水平降低，CYP2E1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，而HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步

14、增加。
　　(2)炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo):MCD模型組大鼠肝臟中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，細(xì)胞漿中IκBα蛋白水平降低，細(xì)胞核中NFκBp65蛋白水平增加。H2S治療組與模型組相比，大鼠肝臟中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞漿中IκBα蛋白水平增加，細(xì)胞核中NFκBp65蛋白水平減少。
　　(3)肝臟脂質(zhì)沉積以及相關(guān)脂肪酸代謝基因的表達(dá):MCD模型組大鼠肝臟中膽固醇和甘油三脂的水平明顯增加

15、，PPARα，SREBP-1c，F(xiàn)AS，和L-FABP的mRNA水平降低，CD36，TLR-2和TLR-4的mRNA水平增加;H2S治療降低了MCD模型組大鼠肝臟中膽固醇和甘油三脂的水平，增加了PPARα和L-FABP的mRNA水平，降低了CD36，TLR-2和TLR-4的mRNA水平，進(jìn)一步降低了SREBP-1c和FAS的mRNA水平。
　　2.HFD誘導(dǎo)形成NASH大鼠模型，同時(shí)腹腔注射硫氫化鈉（NaHS，H2S供體）治療8周

16、。
　　(1)肝臟損傷指標(biāo):HFD模型組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平增加;H2S治療組與模型組相比，ALT和AST水平降低。
　　(2)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo):HFD模型組大鼠肝臟中丙二醛（MDA，脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志分子）水平增加，CYP2E1和HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加;H2S治療組與HFD模型組相比，MDA水平降低，CYP2E1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，而HO-1的mRNA

17、和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加。
　　(3)炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo):HFD模型組大鼠肝臟中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，細(xì)胞漿中IκBα蛋白水平降低，細(xì)胞核中NFκBp65蛋白水平增加。H2S治療組與模型組相比，大鼠肝臟中TNFα和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞漿中IκBα蛋白水平增加，細(xì)胞核中NFκBp65蛋白水平減少。
　　(6)肝臟脂質(zhì)沉積以及相關(guān)脂肪酸代謝基因的表達(dá):HFD模型組大鼠肝臟中膽固醇和甘

18、油三脂的水平明顯增加，PPARα，SREBP-1c，F(xiàn)AS，和L-FABP的mRNA水平降低，CD36，TLR-2和TLR-4的mRNA水平增加;H2S治療降低了HFD模型組大鼠肝臟中膽固醇和甘油三脂的水平，增加了PPARα和L-FABP的mRNA水平，降低了CD36，TLR-2和TLR-4的mRNA水平，進(jìn)一步降低了SREBP-1c和FAS的mRNA水平。
　　結(jié)論:
　　本課題探索了H2S在NASH(NASH)發(fā)病過程中

19、的變化以及作用機(jī)制:
　　一、在MCD或HFD誘導(dǎo)的NASH大鼠模型中，大鼠血液和肝臟中的H2S水平都減少。H2S水平的明顯變化提示該分子可能參與NASH的發(fā)病過程。
　　二、在MCD或HFD誘導(dǎo)的NASH大鼠模型中給以外源性H2S治療發(fā)現(xiàn)，NASH的病變狀態(tài)明顯減弱，凋亡減少，胰島素耐受情況得到好轉(zhuǎn)（僅限于HFD誘導(dǎo)的NASH模型），肝臟中脂質(zhì)沉積水平降低，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕。結(jié)果提示NASH過程中H2S水平的降低可能