羥基紅花黃色素A通過(guò)PI3K-Akt-Hexokinase Ⅱ途徑在缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中的保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：（HydroxysaffloryellowA,HYSA)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的活力影響
　　目的：
　　冠脈介入治療、冠脈搭橋和冠脈溶栓等治療手段是目前臨床心臟相關(guān)疾病治療的主要手段，但是伴隨而來(lái)的是該類(lèi)手術(shù)術(shù)后易導(dǎo)致的心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷的出現(xiàn)，而造成的二次損傷嚴(yán)重影響患者健康。HYSA是黃酮類(lèi)物質(zhì)，中藥紅花中的主要活性成分，其對(duì)血管組織細(xì)

2、胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，但HYSA在缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用還有待研究。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)釆用H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)體系，建立缺氧/復(fù)氧（Hypoxia/reoxygenation H/R）心肌損傷模型，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)首先考察HYSA對(duì)心肌細(xì)胞的存活率的影響；在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），丙二醛

3、（Methane dicarboxylic aldehyde，MDA）含量，考察HYSA對(duì)細(xì)胞存活率及氧化應(yīng)激損傷的影響；同時(shí)給于PI3K，HKII，ERK抑制劑考察給予抑制劑后HSYA對(duì)H/R H9c2細(xì)胞模型的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組比較，H/R細(xì)胞模型組細(xì)胞存活率明顯降低，給于模型細(xì)胞不同劑量的HSYA后，隨著給藥劑量的增高，表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用。
　　2.與正常組相比較，當(dāng)給于PI3K抑制劑LY29

4、4002或HKII抑制劑3-BrPA后，HSYA保護(hù)作用明顯降低，與未給予抑制劑具有顯著差異。而給于ERK抑制劑后，其對(duì)HSYA的心肌細(xì)胞保護(hù)作用影響較弱，但與單一給于HSYA干預(yù)組無(wú)顯著差異。
　　3.與正常組相比較，模型組細(xì)胞LDH顯著升高，說(shuō)明細(xì)胞線粒體損傷明顯增加，給于HYSA后LDH顯著下降與模型組具有顯著差異；但是當(dāng)給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrP后，HSYA保護(hù)作用顯著降低，而給于ERK抑

5、制劑后，其對(duì)HSYA的心肌細(xì)胞保護(hù)作用雖有所抑制，但與單一給于HSYA干預(yù)組沒(méi)有顯著差異。
　　4.與正常組相比較, H/R細(xì)胞模型組細(xì)胞SOD顯著降低，MDA顯著升高，說(shuō)明細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯增加。給于模型細(xì)胞HSYA后表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，顯著升高SOD并降低MDA含量與模型組具有顯著差異。但是當(dāng)給于PI3K抑制劑LY294002及HKII抑制劑3-BrPA后，HSYA改善細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用明顯降低；而給于ERK抑制劑后，

6、其對(duì)HYSA的心肌細(xì)胞保護(hù)作用有所抑制，但與單一給于HSYA干預(yù)組沒(méi)有顯著差異。
　　第二部分：HYSA對(duì)H9c2心肌細(xì)胞線粒體及能量代謝的影響
　　目的：
　　線粒體在MIRI中起關(guān)鍵性作用。線粒體是細(xì)胞能量的供應(yīng)器， MIRI發(fā)生時(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能紊亂，影響線粒體正常能量供應(yīng)，降低ATP合成；同時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)可以引起線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，繼而激活caspase3，觸發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，HYSA在

7、H9c2心肌細(xì)胞H/R模型中具有一定保護(hù)作用可改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)于細(xì)胞線粒體功能是否具有保護(hù)作用有待考察。
　　方法：
　　本研究通過(guò)考察H9c2細(xì)胞ATP含量，胞漿及線粒體中細(xì)胞色素C含量的變化，考察HSYA對(duì)H/R H9c2細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用，同時(shí)通過(guò)考察細(xì)胞中caspase3活性及采用Annexin-V-FITC雙染考察細(xì)胞凋亡，評(píng)價(jià)HYSA在細(xì)胞凋亡中干預(yù)作用。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組相比較，H

8、/R細(xì)胞模型組細(xì)胞ATP含量顯著降低；給于模型細(xì)胞HYSA可使ATP顯著升高與模型組具有顯著差異；同時(shí)給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后，ATP明顯降低與單一HSYA干預(yù)組具有顯著差異；而給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預(yù)組沒(méi)有顯著差異。
　　2.與正常組相比較，H/R細(xì)胞模型組的細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C含量顯著升高，線粒體中細(xì)胞色素C含量明顯降低；給于模型細(xì)胞HSYA后，可以明顯降低胞漿中的細(xì)胞

9、色素C含量，升高線粒體中含量，表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用。給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后， HSYA保護(hù)作用明顯降低，胞漿中細(xì)胞色素C含量較HYSA組明顯升高，線粒體中細(xì)胞色素C含量降低，與HYSA組具有顯著性差異。而給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預(yù)組沒(méi)有顯著差異。
　　3.與正常組相比較，H/R細(xì)胞模型組細(xì)胞Caspase3含量顯著升高；給于模型細(xì)胞HSYA后，Caspase3含量顯著降低與

10、模型組具有顯著差異；同時(shí)給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后，HSYA保護(hù)作用明顯降低，Caspase3含量明顯升高與HYSA組具有顯著差異；給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預(yù)組沒(méi)有顯著差異。
　　4.與正常組相比較，H/R細(xì)胞模型組細(xì)胞凋亡顯著升高；給于模型細(xì)胞HSYA后細(xì)胞凋亡明顯降低，與模型組具有顯著差異；同時(shí)給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后，凋亡明顯升高，

11、HSYA抑制凋亡作用明顯降低；但給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預(yù)組相比影響較小。
　　第三部分：HYSA對(duì)H9c2心肌細(xì)胞Akt，GSk-3β，HexokinaseII的影響
　　目的：
　　磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-oh kinase，PI3K)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)

12、兩個(gè)信號(hào)通路合稱為再灌注損傷挽救激酶信號(hào)通路。兩個(gè)途徑均參與心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。PI3K/Akt及ERK均可以促進(jìn)GSK-3β磷酸化，從而降低線粒體ATP的消耗，減少ROS的生成。HKII是糖酵解關(guān)鍵限速酶，可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控，Akt磷酸化可激活的HKII與線粒體結(jié)合，保護(hù)線粒體功能。我們研究發(fā)現(xiàn)HYSA對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，但在給于PI3K，ERK，HKII抑制劑下其保護(hù)作用不同。本研究將考察HYSA

13、對(duì)細(xì)胞中PI3K，ERK，HKII途徑的影響。
　　方法：
　　本研究將通過(guò)建立H/R H9c2細(xì)胞，通過(guò)給于HYSA及不同抑制劑，采用Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞p-Akt，p-GSK-3β，HKⅡ蛋白含量考察HYSA對(duì)RISK途徑及HK途徑的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組相比較，H/R細(xì)胞模型組細(xì)胞胞漿中p-Akt有所升高；給于模型細(xì)胞HSYA后，細(xì)胞中p-Akt含量顯著升高，與模型組具有

14、顯著差異。同時(shí)給于PI3K抑制劑LY294002后，p-Akt含量較明顯降低，PI3K抑制劑LY294002明顯降低了HYSA對(duì)細(xì)胞p-Akt的誘導(dǎo)作用。
　　2.與正常組相比較，H/R細(xì)胞模型組細(xì)胞胞漿中p-GSK-3β有所升高；給于模型細(xì)胞HYSA后，細(xì)胞中GSK-3β含量有所升高，與模型組具有顯著差異。但與其對(duì)Akt的激活作用明顯較弱，同時(shí)給于ERK抑制劑 PD98059后，GSK-3β含量明顯降低，ERK抑制劑PD9805

15、9明顯降低了HYSA對(duì)細(xì)胞p-GSK-3β的誘導(dǎo)作用。
　　3.與正常組相比較，H/R細(xì)胞模型組細(xì)胞中HKII顯著降低；但給于模型細(xì)胞HYSA后，細(xì)胞中HKII含量顯著升高，與模型組及空白組具有顯著差異。同時(shí)給于HKII抑制劑3-BrPA后，HKII含量明顯降低，HKII抑制劑3-BrPA明顯降低了HSYA對(duì)細(xì)胞HKII的誘導(dǎo)作用。
　　結(jié)論：
　　1.在H/R細(xì)胞模型中，HYSA對(duì)細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用并呈濃度依賴性。

16、
　　2.HYSA可顯著降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，減少細(xì)胞中細(xì)胞色素C、caspase3的水平和細(xì)胞凋亡，同時(shí)恢復(fù)線粒體能量代謝。
　　3.PI3K抑制劑預(yù)處理（LY294002）或給于HKII抑制劑（3-BrPA）， HYSA的保護(hù)作用明顯減弱。相反，ERK抑制劑（PD98059）預(yù)處理，對(duì)HYSA的心肌細(xì)胞保護(hù)作用影響不顯著。
　　4.ERK通過(guò)磷酸化GSK3-β發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但HYSA對(duì)GSK3-β磷酸化效果較弱