葛根素代謝產(chǎn)物M2對抗AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大的機制研究.pdf

1、目的：
　　觀察葛根素代謝產(chǎn)物 M2的抗氧化效應(yīng)；用葛根素代謝產(chǎn)物 M2干預(yù)AngII(AngiotensinⅡ)刺激的心肌細胞，觀察其對AngII誘導(dǎo)肥大的影響以及心肌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標的變化情況，探討氧化應(yīng)激與心肌細胞肥大之間可能的機制，為心肌肥大的發(fā)病機制及臨床藥物防治提供依據(jù)。
　　方法：
　　采用分步消化、差速貼壁、化學抑制法分離純化新生 SD大鼠心肌細胞，作原代培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡、透射電鏡進行細胞鑒定。用

2、黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶作用于心肌細胞，建立心肌細胞氧化應(yīng)激模型，DHE標記細胞檢測細胞內(nèi)超氧陰離子水平。葛根素及其代謝產(chǎn)物M2、血管緊張素II干預(yù)心肌細胞后，DHE標記細胞檢測細胞內(nèi)超氧陰離子水平，F(xiàn)RAP法檢測細胞內(nèi)總抗氧化能力、WST法檢測細胞內(nèi)總SOD活性，鬼筆環(huán)肽標記心肌細胞，熒光顯微鏡拍攝圖片，計算細胞表面積大小。熒光定量PCR檢測肥大基因和NADPH氧化酶基因的表達。
　　結(jié)果：
　　1.葛根素及其代謝產(chǎn)物M2對氧

3、化應(yīng)激的影響；
　　1.1、氧化應(yīng)激模型的建立
　　黃嘌呤（500μmol/l）/黃嘌呤氧化酶（2U/L）作用心肌細胞24-36小時后，心肌細胞內(nèi)超氧陰離子水平明顯升高(P＜0.05)，細胞內(nèi)總抗氧化能力和總SOD活性無明顯變化(P﹥0.05)。
　　1.2、心肌細胞內(nèi)超氧陰離子測定；
　　M2（10-7mol/l）分別干預(yù)24-36h后，DHE標記心肌細胞，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光強度變化，拍攝的圖片用IPP6

4、.0進行熒光強度分析，與陽性對照組（黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶組）相比較，平均光密度明顯降低(P＜0.05)；用熒光掃描儀進行熒光強度的檢測，M2干預(yù)組所測得的熒光 ID值明顯低于陽性對照組(P＜0.05)。
　　1.3、細胞內(nèi)總抗氧化能力測定；
　　M2（10-7mol/l）干預(yù)24-36h后，用FRAP法測定細胞內(nèi)總抗氧化能力，測得 M2干預(yù)組細胞內(nèi)的總抗氧化能力明顯高于空白對照組和黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶組(P＜0.05)。

5、r>　　1.4、總SOD活性測定；
　　M2（10-7mol/l）干預(yù)24-36h后，用WST法測定心肌細胞內(nèi)的總SOD活性，測得M2干預(yù)組細胞內(nèi)的總SOD活性明顯高于空白對照組和黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶組(P＜0.05)。
　　2.葛根素代謝產(chǎn)物M2對抗AngII誘導(dǎo)心肌細胞肥大相關(guān)機制的探討
　　1、AngII對心肌細胞肥大的影響
　　1.1、心肌細胞內(nèi)肥大基因ANF、β-MHCmRNA的表達
　　AngI

6、I（10-6mol/l）刺激心肌細胞36小時，熒光定量PCR檢測心肌細胞內(nèi)肥大基因ANF、β-MHCmRNA的表達，相比空白對照組，兩種均明顯升高(P＜0.05)。
　　1.2、心肌細胞表面積測定
　　AngII（10-6mol/l）刺激心肌細胞36小時，用鬼筆環(huán)肽標記心肌細胞，熒光顯微鏡拍照，用軟件測量心肌細胞表面積的大小，細胞表面積較空白對照組明顯增大(P＜0.05)。
　　2、AngII對心肌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

7、
　　2.1、心肌細胞內(nèi)超氧陰離子水平的變化；
　　AngII（10-6mol/l）刺激心肌細胞36小時，DHE標記心肌細胞，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光強度變化，拍攝的圖片用IPP6.0進行熒光強度分析，對空白對照組相比，平均光密度明顯升高(P＜0.05)；用熒光掃描儀進行熒光強度的檢測，AngII干預(yù)組所測得的熒光 ID值明顯低于陽性對照組(P＜0.05)。
　　2.2、心肌細胞內(nèi)NADPH氧化酶P47phox的表達；

8、
　　AngII（10-6mol/l）刺激心肌細胞36小時，熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)NADPH氧化酶P47phox mRNA的表達，比較空白對照組，P47phox mRNA表達明顯升高(P＜0.05)。
　　2.3、心肌細胞內(nèi)總抗氧化能力和總SOD活性的檢測；
　　AngII（10-6mol/l）刺激心肌細胞36小時，分別用FRAP法和WST法檢測細胞內(nèi)的總抗氧化能力和總SOD活性，與空白對照組相比，稍有升高，但無顯著

9、性差異(P﹥0.05)。
　　3、M2對AngII誘導(dǎo)心肌細胞肥大的影響
　　3.1、M2干預(yù)后心肌細胞肥大基因ANF、β-MHCmRNA的表達
　　M2與AngII共同作用36h后，檢測細胞內(nèi)肥大基因ANF、β-MHCmRNA的表達，M2+AngII組相比AngII組，ANF、β-MHCmRNA的表達明顯降低(P＜0.05)。
　　3.2、M2干預(yù)后心肌細胞面積大小變化
　　M2與AngII一起作用36h

10、后，測定細胞面積大小，M2+AngII組相比AngII組，心肌細胞面積明顯減小(P＜0.05)。
　　4、M2對AngII誘導(dǎo)心肌細胞肥大時氧化應(yīng)激的影響
　　4.1、心肌細胞內(nèi)超氧陰離子水平的變化；
　　M2與AngII一起作用36h后，DHE標記心肌細胞，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光強度變化，拍攝的圖片用IPP6.0進行熒光強度分析，與 AngII組相比，平均光密度明顯降低(P＜0.05)；用熒光掃描儀進行熒光強度的檢

11、測，M2干預(yù)組所測得的熒光ID值明顯高于AngII組(P＜0.05)。
　　4.2、心肌細胞內(nèi)NADPH氧化酶P47phox的表達；
　　M2與AngII一起作用36h后，熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)NADPH氧化酶P47phox mRNA的表達，比較AngII組，P47phox mRNA表達明顯升高(P＜0.05)。
　　4.3、心肌細胞內(nèi)總抗氧化能力和總SOD活性的檢測
　　M2與AngII一起作用36h后，分別