miR-214對Ubc9的表達調(diào)控及其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響.pdf

1、SUMO(small ubiquitin-like modifier，泛素類似分子家族成員)。Sumoylation是蛋白質(zhì)修飾的一種，與泛素化修飾過程類似，通過級聯(lián)的酶促反應，將SUMO分子共價交聯(lián)到目的蛋白的賴氨酸殘基上，即完成SUMO化修飾。蛋白質(zhì)的SUMO化修飾涉及眾多的細胞生理和病理過程，包括腫瘤的發(fā)生。
　　 Ubc9(ubiquitin-like protein SUMO conjugating enzyme9)是

2、SUMO化修飾中唯一的E2結合酶，其結構和功能的異常直接影響細胞蛋白SUMO化水平。已有文獻報道，在卵巢癌等腫瘤中存在Ubc9表達升高的現(xiàn)象，提示Ubc9的高表達可能與腫瘤的發(fā)生有關。
　　 本部分研究中，我們首先選了9例神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本組織（包括Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級各3例）、4株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(T98G、A172、U87MG和U251)和2例正常腦組織，用Western blot的方法檢測了Ubc9在其中的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，在神

3、經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中Ubc9的表達高于正常腦組織，且其表達和病理分級相關，病理分級越高，Ubc9表達越高;細胞系中除U87MG外Ubc9的表達均表現(xiàn)為不同程度的升高。Real-timePCR結果表明四株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中Ubc9的mRNA表達量與蛋白表達量并不匹配，提示在膠質(zhì)瘤細胞中存在Ubc9表達的轉錄后調(diào)控機制，miRNA可能參與了Ubc9的表達調(diào)控。
　　 MiRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，在哺乳動物細胞中主要通過以不完全

4、互補的形式結合到目的基因的3'非編碼區(qū)(3'UTR)，來抑制靶基因的表達，是一種重要的蛋白表達調(diào)控方式，在腫瘤發(fā)生過程中起到十分重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs在膠質(zhì)瘤中表達異常。
　　 我們結合生物信息學和生物學實驗尋找可能作用于Ubc9的miRNA:首先利用TargetScan等對Ubc9的3'端非編碼區(qū)可能結合的miRNA進行了生物信息學分析，并用Real-time PCR檢測了部分miRNAs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞

5、系中的表達。依據(jù)Ubc9蛋白表達水平在膠質(zhì)瘤中有升高的趨勢，故選擇在膠質(zhì)瘤中表達降低的miRNA，實驗結果表明miR-214和miR-203在神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理組織中低表達。后續(xù)的蛋白水平分析和熒光素酶活性分析結果進一步確定miRNA-214是Ubc9表達的調(diào)控因子。
　　 為進一步驗證miR-214對Ubc9的表達調(diào)控，將miR-214的成熟序列轉染T98G細胞和A172細胞，MTT實驗檢測到T98G和A172細胞增殖減緩，隨后用

6、TUNEL顯色檢測了細胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)miR-214過表達后細胞發(fā)生凋亡的比例與對照組相比明顯升高，且有統(tǒng)計學差異。Western blot結果表明在兩種細胞系中miR-214的過表達下調(diào)了細胞內(nèi)源性Ubc9的表達。
　　 將針對Ubc9的siRNA序列分別轉染T98G和A172細胞，采用相同的實驗方法檢測細胞的變化，結果表明:在兩種細胞系中，Ubc9的敲低會引起細胞增殖減緩，而TUNEL顯色實驗亦發(fā)現(xiàn)Ubc9敲低后細胞發(fā)生凋

7、亡的比例明顯升高，說明Ubc9的表達變化影響了細胞凋亡相關的通路。siRNA引起的細胞學效應與miR-214過表達導致的類似，進一步說明miR-214影響到神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Ubc9的表達。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)轉染針對Ubc9的siRNA序列或miR-214成熟序列引起的Ubc9表達水平降低均伴隨著細胞SUMO化程度的減弱，表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-214通過對Ubc9的表達調(diào)控影響了細胞的SUMO化狀態(tài)。
　　 從上述實驗