冬凌草甲素抑制食管上皮細胞轉化的分子機制研究.pdf

1、目的:
　　食管癌(Esophageal Cancer, EC)是常見的上消化道腫瘤。我國是世界上食管癌高發(fā)區(qū)之一，主要高發(fā)省份為河北、河南、福建和重慶，尤其在河北省磁縣、河南省林州發(fā)病率和死亡率較高。食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個長期的過程，食管癌的發(fā)生經歷了食管鱗狀上皮細胞輕、中度不典型增生，重度不典型增生到原位癌、食管鱗狀細胞癌的過程。輕中度不典型增生是重度不典型增生之前的一個階段，具有雙向不穩(wěn)定性，如對此階段進行藥物干預，阻止其向

2、重度不典型增生及原位癌階段發(fā)展，則能夠達到預防食管鱗癌發(fā)生的目的。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內信號轉導通路(Wnt、Notch、Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR)的激活對食管癌的發(fā)生、發(fā)展起到重要的作用。因此，針對信號通路中特定信號分子靶向作用可能為食管癌預防和治療的新方法。
　　冬凌草為唇形科香茶菜屬植物，民間主要用來治療咽喉腫痛、蟲蛇咬傷和防治食管癌，冬凌草甲素為其主要抗腫瘤成分之一。臨床實驗證明，冬凌草能夠明顯

3、緩解腫瘤癥狀，如食管癌、賁門癌、原發(fā)性肝癌和乳腺癌等，能夠穩(wěn)定和縮小腫瘤體積并且能夠延長患者生命，對其抗腫瘤機制多集中于對腫瘤細胞的殺傷作用、誘導腫瘤細胞凋亡、增強其他抗腫瘤藥物療效等方面。但該化合物對食管早期輕中度不典型增生是否有抑制作用并在食管癌的化學預防中發(fā)揮作用并不清楚。本研究以表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)誘導食管上皮細胞轉化為模型，探索冬凌草甲素對食管上皮細胞轉化的抑制作用及其相應分

4、子機制，以期為早期食管癌化學預防提供依據。
　　材料與方法:
　　1．SHEE細胞毒性實驗：檢測不同濃度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素對SHEE細胞的毒性作用，篩選出細胞增殖抑制實驗的藥物濃度。
　　2．SHEE細胞的增殖抑制實驗：根據細胞毒性實驗結果篩選出的最大藥物濃度為20μM，設置細胞增殖抑制實驗藥物濃度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM)，檢測不同濃度冬凌草甲素在不同時間

5、點(0h、24h、48h、72h和96h)對SHEE細胞的增殖抑制作用。
　　3．軟瓊脂克隆形成實驗：觀察不同濃度(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF，EGF濃度為10ng/ml)的冬凌草甲素對EGF誘導的SHEE細胞轉化能力的影響。
　　4．磷酸蛋白激酶芯片檢測：用DMSO、EGF(10ng/ml)、冬凌草甲素(20μM)+EGF(10ng/ml)處理細

6、胞，通過磷酸蛋白激酶芯片，篩選出冬凌草甲素能夠抑制EGF誘導的蛋白激酶。
　　5．蛋白印跡實驗：驗證磷酸蛋白激酶芯片結果，確定冬凌草甲素抑制EGF誘導的磷酸蛋白激酶。
　　6．對細胞信號通路EGFR/Akt/GSK-3β、EGFR/Akt/mTOR和EGFR/ERK/RSK的檢測：通過藥物濃度梯度蛋白印跡實驗，探究不同濃度冬凌草甲素(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20

7、μM+EGF， EGF濃度為10ng/ml)對EGF誘導的蛋白激酶磷酸化的抑制作用，并且和已知PI3K抑制劑LY294002的抑制作用進行對比。
　　結果:
　　1．不同濃度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素分別作用于SHEE細胞24和48 h，CCK-8法測定OD值，以實驗組/對照組的比值為縱坐標，冬凌草甲素的濃度為橫坐標作出細胞生存率曲線，得出冬凌草甲素對SHEE細胞80％存活率約為20μM。

8、
　　2．不同濃度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM)的冬凌草甲素分別作用于SHEE細胞0h、24h、48h、72h和96h，CCK-8法測定OD值，以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標作出不同藥物濃度的細胞增殖曲線，發(fā)現(xiàn)較低劑量冬凌草甲素和短時間處理對SHEE細胞并沒有明顯的增殖抑制作用，20μM濃度的冬凌草甲素作用72h和96h后能夠抑制SHEE細胞的增殖(P<0.05)。
　　3．不同濃度(DMSO、EGF、1μM+

9、EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF，EGF濃度為10ng/ml)的冬凌草甲素軟瓊脂克隆形成實驗，DMSO組細胞沒有轉化，處于單個分散狀態(tài)，EGF組細胞轉化能力強且克隆數(shù)量多，冬凌草甲素組隨著濃度的增高細胞轉化能力降低且克隆數(shù)量變少(P<0.05)。
　　4．蛋白芯片通過計算灰度值顯示出結果，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能夠抑制Akt/mTOR和Akt/GSK3β的磷酸化，冬凌草甲素對EGF誘導的ERK

10、/RSK信號通路磷酸化水平沒有抑制作用。
　　5．蛋白印跡實驗結果和芯片結果保持一致。
　　6．藥物濃度梯度蛋白印跡實驗結果發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對EGF誘導的Akt/mTOR和Akt/GSK3β磷酸化的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05)，和PI3K抑制劑LY294002相比，沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　結論：
　　1．冬凌草甲素可抑制食管上皮細胞SHEE的增殖，并且能夠抑制EGF誘導的SHEE細胞轉化。