冬凌草甲素抑制食管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　食管癌(Esophageal Cancer, EC)是常見(jiàn)的上消化道腫瘤。我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)區(qū)之一，主要高發(fā)省份為河北、河南、福建和重慶，尤其在河北省磁縣、河南省林州發(fā)病率和死亡率較高。食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，食管癌的發(fā)生經(jīng)歷了食管鱗狀上皮細(xì)胞輕、中度不典型增生，重度不典型增生到原位癌、食管鱗狀細(xì)胞癌的過(guò)程。輕中度不典型增生是重度不典型增生之前的一個(gè)階段，具有雙向不穩(wěn)定性，如對(duì)此階段進(jìn)行藥物干預(yù)，阻止其向

2、重度不典型增生及原位癌階段發(fā)展，則能夠達(dá)到預(yù)防食管鱗癌發(fā)生的目的。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Wnt、Notch、Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR)的激活對(duì)食管癌的發(fā)生、發(fā)展起到重要的作用。因此，針對(duì)信號(hào)通路中特定信號(hào)分子靶向作用可能為食管癌預(yù)防和治療的新方法。
　　冬凌草為唇形科香茶菜屬植物，民間主要用來(lái)治療咽喉腫痛、蟲(chóng)蛇咬傷和防治食管癌，冬凌草甲素為其主要抗腫瘤成分之一。臨床實(shí)驗(yàn)證明，冬凌草能夠明顯

3、緩解腫瘤癥狀，如食管癌、賁門(mén)癌、原發(fā)性肝癌和乳腺癌等，能夠穩(wěn)定和縮小腫瘤體積并且能夠延長(zhǎng)患者生命，對(duì)其抗腫瘤機(jī)制多集中于對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物療效等方面。但該化合物對(duì)食管早期輕中度不典型增生是否有抑制作用并在食管癌的化學(xué)預(yù)防中發(fā)揮作用并不清楚。本研究以表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor, EGF)誘導(dǎo)食管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為模型，探索冬凌草甲素對(duì)食管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制作用及其相應(yīng)分

4、子機(jī)制，以期為早期食管癌化學(xué)預(yù)防提供依據(jù)。
　　材料與方法:
　　1．SHEE細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)不同濃度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素對(duì)SHEE細(xì)胞的毒性作用，篩選出細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。
　　2．SHEE細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)：根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出的最大藥物濃度為20μM，設(shè)置細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)藥物濃度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM)，檢測(cè)不同濃度冬凌草甲素在不同時(shí)間

5、點(diǎn)(0h、24h、48h、72h和96h)對(duì)SHEE細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　3．軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)：觀察不同濃度(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF，EGF濃度為10ng/ml)的冬凌草甲素對(duì)EGF誘導(dǎo)的SHEE細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響。
　　4．磷酸蛋白激酶芯片檢測(cè)：用DMSO、EGF(10ng/ml)、冬凌草甲素(20μM)+EGF(10ng/ml)處理細(xì)

6、胞，通過(guò)磷酸蛋白激酶芯片，篩選出冬凌草甲素能夠抑制EGF誘導(dǎo)的蛋白激酶。
　　5．蛋白印跡實(shí)驗(yàn)：驗(yàn)證磷酸蛋白激酶芯片結(jié)果，確定冬凌草甲素抑制EGF誘導(dǎo)的磷酸蛋白激酶。
　　6．對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路EGFR/Akt/GSK-3β、EGFR/Akt/mTOR和EGFR/ERK/RSK的檢測(cè)：通過(guò)藥物濃度梯度蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，探究不同濃度冬凌草甲素(DMSO、EGF、1μM+EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20

7、μM+EGF， EGF濃度為10ng/ml)對(duì)EGF誘導(dǎo)的蛋白激酶磷酸化的抑制作用，并且和已知PI3K抑制劑LY294002的抑制作用進(jìn)行對(duì)比。
　　結(jié)果:
　　1．不同濃度(DMSO、1、5、10、25、50和100μM)的冬凌草甲素分別作用于SHEE細(xì)胞24和48 h，CCK-8法測(cè)定OD值，以實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組的比值為縱坐標(biāo)，冬凌草甲素的濃度為橫坐標(biāo)作出細(xì)胞生存率曲線，得出冬凌草甲素對(duì)SHEE細(xì)胞80％存活率約為20μM。

8、
　　2．不同濃度(DMSO、1、2.5、5、10和20μM)的冬凌草甲素分別作用于SHEE細(xì)胞0h、24h、48h、72h和96h，CCK-8法測(cè)定OD值，以吸光度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作出不同藥物濃度的細(xì)胞增殖曲線，發(fā)現(xiàn)較低劑量冬凌草甲素和短時(shí)間處理對(duì)SHEE細(xì)胞并沒(méi)有明顯的增殖抑制作用，20μM濃度的冬凌草甲素作用72h和96h后能夠抑制SHEE細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
　　3．不同濃度(DMSO、EGF、1μM+

9、EGF、2.5μM+EGF、5μM+EGF、10μM+EGF和20μM+EGF，EGF濃度為10ng/ml)的冬凌草甲素軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，DMSO組細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)化，處于單個(gè)分散狀態(tài)，EGF組細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)且克隆數(shù)量多，冬凌草甲素組隨著濃度的增高細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力降低且克隆數(shù)量變少(P<0.05)。
　　4．蛋白芯片通過(guò)計(jì)算灰度值顯示出結(jié)果，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能夠抑制Akt/mTOR和Akt/GSK3β的磷酸化，冬凌草甲素對(duì)EGF誘導(dǎo)的ERK

10、/RSK信號(hào)通路磷酸化水平?jīng)]有抑制作用。
　　5．蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果和芯片結(jié)果保持一致。
　　6．藥物濃度梯度蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對(duì)EGF誘導(dǎo)的Akt/mTOR和Akt/GSK3β磷酸化的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性(P<0.05)，和PI3K抑制劑LY294002相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1．冬凌草甲素可抑制食管上皮細(xì)胞SHEE的增殖，并且能夠抑制EGF誘導(dǎo)的SHEE細(xì)胞轉(zhuǎn)化。