姜黃素通過NF-κB通路調(diào)控IL-1β誘導骨關節(jié)炎的相關實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　探討姜黃素（Curcumin）在IL-1β誘導骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）中抑制Ⅱ型膠原、促進MMIP-13的調(diào)控作用及其可能機制，明確姜黃素在骨關節(jié)炎治療的作用及其相關機制。
　　研究方法：
　　1、軟骨細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　2、IL-1β對軟骨細胞Ⅱ型膠原、MMP-13表達的影響。IL-1β刺激軟骨細胞24h，RT-qPCR和Western Blotting技術檢測Ⅱ

2、型膠原（typeⅡ collagen,COL2A1）及基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）mRNA及蛋白表達水平。
　　3、姜黃素對IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原、上調(diào)MMP-13表達的影響。予以50μM濃度的姜黃素干預IL-1β刺激的軟骨細胞，Western Blotting檢測不同時間點Ⅱ型膠原及MMP-13蛋白的表達水平；然后以不同濃度的姜黃素干預大鼠軟骨細胞，培養(yǎng)48h后再次

3、觀察Ⅱ型膠原及MMP-13蛋白的表達水平，確定細胞實驗中姜黃素干預效用最佳的時間及濃度。
　　4、姜黃素對IL-1β刺激的軟骨細胞增殖活性的影響。給予IL-1β預刺激24h后，分為空白對照組、Curcumin組、PDTC組和Curcumin+PDTC組，藥物不同時間點干預軟骨細胞，CCK8檢測比較四組軟骨細胞增殖能力的差異。
　　5、姜黃素在調(diào)控IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原、上調(diào)MMP-13表達可能的機制。IL-1β加或不加姜黃素

4、刺激軟骨細胞不同時間點，分別提取總蛋白，胞漿蛋白和胞核蛋白，Western Blotting檢測IκBα、p-IκBα及核內(nèi)外P65的蛋白表達水平。繼續(xù)取第一代軟骨細胞培養(yǎng)，分為空白對照組、IL-1β組、IL-1β+Curcumin組和IL-1β+PDTC(Pyrrol idinedithiocarbamic acid，inhibitor of NF-κB，0.1 mmol/L)組，免疫熒光技術檢測各組NF-κB(nuclear fac

5、tor-κappaB) p65核內(nèi)外的表達情況。
　　研究結果：
　　1、成功分離大鼠軟骨細胞，并通過甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化加以鑒定。
　　2、IL-1β顯著增加大鼠軟骨細胞MMP-13表達，并顯著降低Ⅱ型膠原mRNA及蛋白的表達。
　　3、姜黃素能夠逆轉IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原的表達，上調(diào)MMP-13的表達。對IL-1β刺激的軟骨細胞最佳處理時間的測定：在不同時間點姜黃素干預下 MMP-13顯著下降，而Ⅱ

6、型膠原顯著增加，MMP-13在36 h達到峰值，Ⅱ型膠原在48 h達到峰值。姜黃素對IL-1β刺激的軟骨細胞最佳處理濃度的測定：在不同濃度的姜黃素干預下，明顯上調(diào)Ⅱ型膠原的表達，并顯著抑制 IL-1β預處理中軟骨細胞MMP-13表達，姜黃素對Ⅱ型膠原和MMP-13表達調(diào)控的最佳濃度為50μM。
　　4、姜黃素能夠逆轉IL-1β抑制軟骨細胞增殖活性。IL-1β刺激的軟骨細胞藥物干預治療后增殖活性逐漸增加，而IL-1β單獨處理的軟骨細

7、胞增殖活性逐漸降低。雖然每個藥物干預組細胞增殖活性顯著升高，但各治療組間軟骨細胞增殖活性無顯著差異。
　　5、姜黃素能夠逆轉IL-1β下調(diào)Ⅱ型膠原的表達，上調(diào)MMP-13的表達可能是通過抑制NF-κB通路調(diào)控的。IL-1β刺激的軟骨細胞，NF-κB p65核內(nèi)移表現(xiàn)增加，姜黃素能夠逆轉NF-κB p65核內(nèi)移，顯著上調(diào)p65在核外的表達，使胞漿蛋白p65表達水平明顯下降。與NF-κB抑制劑(PDTC)具有相似的功能。此外，姜黃素能

8、夠拮抗IL-1β誘導軟骨細胞IκBα的磷酸化，抑制p-IκBα水平上升。
　　研究結論：
　　1、IL-1β抑制軟骨細胞Ⅱ型膠原、促進MMP-13的表達。
　　2、姜黃素能夠逆轉IL-1β刺激的軟骨細胞下調(diào)Ⅱ型膠原、上調(diào)MMP-13表達效應，在這里我們選用最佳的作用時間和濃度為48 h和50μM。
　　3、姜黃素能夠逆轉IL-1β抑制軟骨細胞增殖活性，在實驗濃度無明顯細胞毒副作用。
　　4、姜黃素通過抑制I