Il-1β預處理可通過NF-κB信號途徑促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化潛能.pdf

1、目的:研究不同方式白細胞介素-1β(IL-1β)預刺激骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)后，對核因子-kB(NF-kB)通路以及對成骨分化能力等的影響。
　　方法:1、Western blot方法檢測IL-1β預刺激BMMSCs后ikbα和P-ikbα表達。實驗分為三組:1）對照組A:BMMSCs陰性、2）實驗組B: IL-1β預刺激BMMSCs一天組3）實驗組C:IL-1β預刺激BMMSCs七天組。A、B、C組細胞收集提取總蛋白，

2、使用western blot方法檢測三組BMMSCs中ikbα和P-ikbα蛋白的表達水平，并進行統(tǒng)計學分析比較。
　　2、細胞免疫組織化學染色:對照組A、實驗組B、實驗組C的BMMSCs在預刺激結(jié)束后，采用細胞免疫組織化學染色方法檢測各組BMMSCs的BMP-2、p-Smad1/5/8蛋白表達情況。
　　3、RT-PCR方法測定IL-1β預刺激BMMSCs后IGF-1、EphB4、OPG基因表達。A、B、C組細胞預刺激結(jié)束

3、后，收集各組細胞部分提取總RNA，Real-Time PCR法測定三組BMMSCs中IGF-1、EphB4、OPG表達水平的變化，并進行統(tǒng)計學分析比較。
　　4、誘導BMMSCs成骨分化:實驗分為四組:1）對照組A:BMMSCs陰性未誘導成骨組2）對照組B:BMMSCs陰性誘導成骨組3）實驗組C: IL-1β預刺激BMMSCs一天組4）實驗組D:IL-1β預刺激BMMSCs七天組。預刺激結(jié)束后B、C、D組加入成骨細胞誘導液，誘導1

4、4天后取堿性磷酸酶(ALP)進行染色，誘導21天后取茜素紅(Alizarin Red)進行染色，以檢測BMMSCs成骨分化的能力。實驗還同時加用NF-kB的抑制劑(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)，研究IL-1β對BMMSCs成骨分化作用的影響。
　　結(jié)果:1、倒置顯微鏡下觀察，對照組A、實驗組B、C三組的BMMSCs形態(tài)都以長梭形為主，呈貼壁方式生長，三組BMMSCs形態(tài)上未見明顯差異。

5、　　2、Western blot結(jié)果表明:與A組相比，B組、C組的ikbα蛋白水平的表達降低(P＜0.05)，P-ikbα蛋白水平的表達增高(P＜0.05)。
　　3、細胞免疫組織化學染色結(jié)果顯示:與A組相比，B組、C組的BMP-2水平的表達增高，p-Smad1/5/8的表達無明顯變化。
　　4、Real-time-PCR結(jié)果顯示:與A組相比，B組和C組的IGF-1、EphB4、OPGmRNA表達水平上調(diào)(P＜0.05)。<

6、br>　　5、檢測BMMSCs成骨能力:采用Alizarin Red染色及ALP染色方法后結(jié)果顯示:B、C、D三組BMMSCs均有向成骨分化的能力;但與B組相比，C組和D組的成骨分化能力較強，鈣基質(zhì)沉積較多，而加用NF-kB抑制劑后，C組和D組的成骨分化能力減弱，鈣基質(zhì)沉積較少。
　　結(jié)論:1、實驗組與對照組細胞生長形態(tài)基本上一致。
　　2、和對照組相比，BMMSCs經(jīng)IL-1β預處理后，其成骨分化活性增強，且多次IL-1β