通過(guò)改變Smad4的表達(dá)研究BMP7-Smad4-Id2信號(hào)通路在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制.pdf

1、第一部分Smad4蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義
　　 目的：探討Smad4蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床、病理之間的關(guān)系。方法：利用免疫組化S-P法檢測(cè)60例大腸癌組織、27例癌旁正常組織中Smad4的表達(dá)；回顧性收集相應(yīng)患者的臨床病理資料。結(jié)果：Smad4在大腸癌原發(fā)灶中的免疫組化切片評(píng)分，與癌旁正常組織相比，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，U=294.50，有顯著性差異(P＜0.001)；Smad4的表達(dá)情況

2、與腫瘤的浸潤(rùn)層次，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Dukes分期有關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論：Smad4的低表達(dá)可能與大腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Smad4可以作為大腸癌的預(yù)后指標(biāo)和基因靶向治療的有效靶點(diǎn)。
　　 第二部分Smad4表達(dá)下降對(duì)大腸癌細(xì)胞HCT116增殖性、遷移性、侵襲性以及BMP7-SmRd4-Id2通路的影響(體外實(shí)驗(yàn))
　　 目的：本部分實(shí)驗(yàn)研究HCT116細(xì)胞中的Smad4被小干擾RNA沉默后，是否影響了該細(xì)胞的增殖性、遷移性、

3、侵襲性及細(xì)胞周期，是否影響了BMP7-Smad4-Id2信號(hào)通路的作用。方法：構(gòu)建Smad4-shRNA質(zhì)粒，并通過(guò)轉(zhuǎn)染和篩選形成該質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞。通過(guò)PCR，Western實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Smad4-shRNA質(zhì)粒的作用，并測(cè)量Id2的表達(dá)情況。通過(guò)MTT來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖性的改變，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移性和侵襲性的改變，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞周期的改變。結(jié)果：成功構(gòu)建Smad4-shRNA質(zhì)粒，并形成該

4、質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞株。通過(guò)PCR和Western實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證了Smad4在基因和蛋白水平的降低。同時(shí)，通過(guò)Western實(shí)驗(yàn)，得到干擾質(zhì)粒對(duì)Smad4蛋白的抑制率為47.17％。干擾后的HCT116細(xì)胞，增殖性、遷移性和侵襲性均增強(qiáng)(P＜0.05)，細(xì)胞周期發(fā)生改變。干擾后的HCT116細(xì)胞中Id2的表達(dá)增加，但在該類(lèi)細(xì)胞中BMP7增多不能引起Id2的改變。結(jié)論：在HCT116細(xì)胞中，Smad4的降低可以使細(xì)胞的增殖性、遷移

5、性、侵襲性增加，Smad4是一種抑癌基因。BMP7通過(guò)Smad4改變Id2的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的活性。BMP7-Smad4-Id2在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　 第三部分Smad4表達(dá)下降對(duì)大腸癌細(xì)胞HCT116裸鼠植瘤生長(zhǎng)以及BMP7-Smad4-Id2通路的影響(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))
　　 目的：研究Smad4表達(dá)降低的HCT116細(xì)胞在裸鼠皮下植瘤后腫瘤的生長(zhǎng)情況以及BMP7細(xì)胞因子對(duì)各種細(xì)胞所植腫瘤的影響。方法：用HCT

6、116細(xì)胞，HCT116-HK細(xì)胞，HCT116-Smad4-shRNA細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型，5天后腫瘤形成，將裸鼠分為(1)HCT116組：(2)HCT116-HK組；(3)HCT116+BMP7組；(4)HCT116-Smad4-shRNA組；和(5)HCT116-Smad4-shRNA+BMP7組。五個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組每隔2天瘤周注射0.2ml100ng/ml的BMP7或生理鹽水，重復(fù)4次。觀察腫瘤的大小和重量。通過(guò)PCR和

7、免疫組化，測(cè)量每組腫瘤中Smad4、Id2在基因和蛋白水平上的表達(dá)量。通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)，評(píng)估每組腫瘤細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果：5天后，裸鼠植瘤均成功，腫瘤5-7 mm大小，HCT116-Smad4-shRNA組腫瘤生長(zhǎng)明顯快于HCT116組和HK組。PCR提示HCT116-Smad4-shRNh組腫瘤中Smad4 mRNA表達(dá)降低，Id2 mRNA表達(dá)增加。對(duì)于HCT116-Smad4-shRNA組細(xì)胞所成腫瘤，有無(wú)BMP7作用，不影響I

8、d2的表達(dá)和腫瘤的生長(zhǎng)。TUNEL實(shí)驗(yàn)提示HCT116-Smad4-shRNA組腫瘤中細(xì)胞凋亡降低。結(jié)論：Smad4-shRNA可以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抑制大腸腫瘤的生長(zhǎng)。BMP7-Smad4-Id2細(xì)胞信號(hào)通路在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。
　　 第四部分Smad4再表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞SW480增殖性、遷移性、侵襲性以及BMP7-Smad4-Id2通路的影響(體外實(shí)驗(yàn))
　　 目的：研究Smad4再表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞SW480增殖性

9、和侵襲性的影響；探索BMP7是通過(guò)BMP7-Smad4通路，還是直接對(duì)Id2起調(diào)節(jié)作用，從而使Id2發(fā)生改變而影響細(xì)胞的活性。方法：成功構(gòu)建Smad4-cDNA質(zhì)粒并形成該質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞。通過(guò)Western實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Smad4的再表達(dá)，并測(cè)量Id2的蛋白表達(dá)情況。通過(guò)MTT來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖性的改變，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移性和侵襲性的改變，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞周期的改變。結(jié)果：成功構(gòu)建Smad4-cD

10、NA質(zhì)粒，并形成該質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞株。通過(guò)Western實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Smad4在蛋白水平的再表達(dá)。再表達(dá)后的SW480細(xì)胞，增殖性、遷移性和侵襲性均減弱(P＜0.05)，細(xì)胞周期發(fā)生改變，靜止期細(xì)胞增多。再表達(dá)后的SW480細(xì)胞中Id2的表達(dá)降低，而且在該類(lèi)細(xì)胞中BMP7增多可以使該類(lèi)細(xì)胞的活性增強(qiáng)且引起Id2的增加。結(jié)論：在SW480細(xì)胞中，Smad4的再表達(dá)可以使細(xì)胞的增殖性、遷移性、侵襲性降低，進(jìn)一步證實(shí)Smad4是一種